Generation of polyclonal antibodies directed against AL-kappa light chain amyloid protein

Abstract

1 ГБОУ ВПО Северо-Осетинская государственная медицинская академия Минздрава России, Владикавказ, Россия 2 Институт патологии университета имени Кристиана Альбрехта, Киль, Германия Введение. Классификация амилоидозов основана на белке-предшественнике, который образует амилоидные фибриллы, и распределении амилоидного отложения -системном или локализованном. Наиболее частой формой системного амилоидоза является AL-амилоидоз, при котором амилоидогенный белок состоит из полноразмерных лямбда или каппа легких цепей иммуноглобулина либо их фрагментов. В отличие от других типов амилоидоза AL-амилоидоз трудно классифицировать иммуногистохимическим методом, так как каждый пациент с этим заболеванием обладает индивидуальной последовательностью аминокислот в вариабельном регионе легких цепей и использование стандартного набора антител не всегда дает достоверный результат. Цель работы -получение поликлональных антител к пептидным эпитопам вариабельного и константного регионов каппа легких цепей амилоидного белка. Материалы и методы. Информационный поиск и анализ пяти субклассов амилоидогенных каппа легких цепей иммуноглобулина был проведен с использованием базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI, США) и сведений литературы. Найденные аминокислотные последовательности обрабатывали в программе Tcoffe Regular. Вторичную структуру белка анализировали по методу J.M. Parker et al. (1986) с использованием программного обеспечения Peptide Companion software (CoshiSoft/PeptiSearch, США). После выбора аминокислотных последовательностей проводили синтез двух полипептидов и их очистку методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Для получения поликлональных пептидных антител кроликов новозеландской породы иммунизировали синтетическими пептидами по стандартизированному протоколу (Pineda Antibody-Service, Германия). Сыворотку крови для исследования брали на 60-й и 100-й дни после начала иммунизации, ее эффективность тестировали методом дот-блоттинга. Фракцию IgG выделяли методом аффинной хроматографии на колонке Hi Trap Protein G HP (Amersham Biosciences AB, Германия). Результаты. Анализ 112 аминокислотных последовательностей каппа легких цепей показал, что самым распространенным является субкласс I (87 наблюдений), использованный для составления гипотетической аминокислотной цепи. Первый антигенный эпитоп был выбран из наиболее часто встречающихся аминокислотных остатков вариабельного региона гипотетической цепи и соответствовал аминокислотным позициям 3-17 (QMTQSPSSLSASVGD). Константный регион у всех пяти субклассов был одинаковым, и в качестве второго эпитопа использовали участок, соответствующий аминокислотным позициям 116-130 (FIFPPSDEQLKSGTA). Синтезированные пептиды NH2-CQMTQSPSSLSASVGD-CONH2 и NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2 были очищены методом HPLC (до 86% и 89%, соответственно) и применены для иммунизации. Успешность ее была доказана методом дот-блоттинга, с использованием синтезированных пептидов в качестве позитивного контроля. Выделенные из сыворотки крови IgG антитела давали положительну...