Organ shortage for transplantation and the need for new therapies for the treatment of
tissular damages have driven the development of an exciting field in research, called
tissue engineering (TE). Its potential entails future strategies that will allow the
development of functional substitutes for damaged tissues, obtained in vitro under riskfree
environments, using autologous cells that will integrate within the host aiding in the
regeneration and restore of the lost function. However, still current efforts have to deal
with several restraints in order to achieve that paradigm.
The aim of this thesis focuses in the development of in vitro tissue analogues with
millimetric size (microtissues), using the inherent ability of cells to secrete their own
extracellular matrix (ECM) when they are seeded on a biocompatible scaffold. In this
case, we have used polylactic acid (PLA) microcarriers (MCs) (80 -120 μm in diameter)
as scaffold. PLA has been an extensively used as a biomaterial applied in medicine, as it
is a biodegradable and biocompatible synthetic polymer. Moreover, we have used a green,
non-toxic method for the preparation of PLA MCs that allows a high control over size
and distribution. The use of these MCs provides cells with an ideal three-dimensional
environment for proliferation and secretion of ECM components, which are different than
when exposed to conventional tissue culture plates. Likewise, the use of MCs in the
formation of microtissues allows their aggregation (as building blocks) into bigger
constructs or macrotissues, with high interconnectivity and porosity, as well as the
feasibility to adapt to different shapes.
Firstly, in this thesis we have studied different methodologies for the seeding of cells
on MCs, and the latter formation of microtissues to define the best parameters for a
homogeneous seeding and extensive ECM deposition. For that purpose, we have used a
spinner flask bioreactor promoting a more uniform cell-MC colonization, and ECM
deposition. After optimization, we have evaluated the obtained ECM microtissues,
assessing their components and possible applications. In that case, we introduced the use
of commercially available-gelatine microcarriers for a comparative with PLA MCs. We
assessed whether the secreted ECM differed when using each MCs type. And we could
confirm that the scaffold choice influences cellular behaviour and secreted matrix,
favouring osteogenic with gelatine MCs or potentiating angiogenic capacity with a
mixture of gelatine and PLA MCs.
One of the biggest hurdles that halt the introduction of TE constructs into clinical
applications is the vascularization process for the survival of cells once implanted. The
arrival of nutrients and oxygen must be favoured by a rapid in vivo vascularization. To
aid in this process, we have studied the formation of co-cultured microtissues with
mesenchymal stem and endothelial cells, together with PLA MCs. We were able to
confirm the presence of both cell types in the microtissues, but there were no clear
evidences that the presence of endothelial cells enhanced microtissue vascularization in
mice models.
Finally, we used cell-derived ECM microtissues as a platform for the introduction and
survival of therapeutic cells in an anti-tumoral model. Microtissues acted like a reservoir
for these cells, allowing migration towards the tumour providing their bystander
therapeutic effect. The results of this study demonstrated the efficiency of PLA
microtissues obtained from therapeutic cells in stopping tumour progression. Moreover,
a rapid microtissue vascularization was observed, which favoured cell survival.
To summarise, this thesis describes the fabrication of cell-derived microtissues, created
from seeding cells on PLA microcarriers as a favourable strategy in tissue engineering,
as well as a tool for the delivery and survival of therapeutic cells for anti-tumoral
applications.
La escasez de órganos disponibles para trasplantes y la falta de terapias para el
tratamiento de algunas lesiones tisulares han llevado al desarrollo de un campo de
investigación muy potente, la ingeniería de tejidos (TE). Futuras estrategias permitirán
desarrollar y disponer de nuevos sustitutos para tejidos dañados, construidos de forma
segura, a partir de nuestras propias células y totalmente funcionales que se integrarán en
nuestro cuerpo ayudando a regenerar y restaurar la función perdida. No obstante, para
que este futuro se materialice aún son necesarios muchos esfuerzos que lidien con las
limitaciones que de momento nos encontramos.
El objetivo de esta tesis es el desarrollo in vitro de análogos de tejidos (microtejidos),
utilizando la capacidad de las células de secretar su propia matriz extracelular (ECM)
cuando son sembradas sobre un andamio biocompatible. En este caso, hemos utilizado
micropartículas de ácido poliláctico (PLA) como andamio. Se trata de un material
extensamente aplicado para uso médico, por su biodegradabilidad y biocompatibilidad.
Además, para su producción utilizamos reactivos ecológicos y no tóxicos. El uso de estas
partículas proporciona a las células un entorno tridimensional ideal para proliferar y
secretar proteínas y otros componentes de la ECM, diferentes a cuando se las expone a
entornos en dos dimensiones. Asimismo, su uso en TE permite la agregación de diferentes
microtejidos para la creación de constructos más grandes, presentando una alta
interconectividad y porosidad, así como una elevada facilidad para adaptarse a diferentes
regiones.
Inicialmente, en esta tesis estudiamos diversos métodos de sembrado y de formación
de microtejidos para configurar los parámetros para la obtención de un sembrado extenso
y homogéneo. Esto nos llevó a determinar que el uso de un biorreactor de agitación
promueve un mejor sembrado cosa que luego conlleva a una secreción más homogénea
de ECM por el microtejido. Una vez optimizado, caracterizamos las matrices obtenidas,
evaluando sus componentes y sus posibles aplicaciones. En este caso, utilizamos otras
micropartículas comerciales para su comparativa con nuestras partículas de PLA.
Evaluamos si las matrices obtenidas sembrando las mismas células eran diferentes y
pudimos observar, cómo la elección del andamio influye en el comportamiento celular y
en la matriz secretada favoreciendo en unos casos la diferenciación osteogénica o en otros
su potencial angiogénico.
Una de las mayores limitaciones en la aplicación clínica de los constructos de TE, es
su vascularización. La llegada de nutrientes y oxígeno debe ser favorecida mediante una
rápida vascularización in vivo para la supervivencia de las células del constructo. Para
favorecer este proceso, estudiamos la creación de microtejidos cocultivados con células
mesenquimales y endoteliales, juntamente con las micropartículas de PLA. Pudimos
demostrar la presencia de ambas células en el constructo, aunque no observamos una clara
diferencia en cuanto a vascularización una vez implantados en ratones, con la presencia
de las células endoteliales y sin ellas.
Por último, estudiamos el uso los microtejidos como plataforma para la introducción y
supervivencia de células terapéuticas en un modelo subcutáneo tumoral. Los microtejidos
actúan como reservorio de estas células, permitiendo la migración hacia el tumor, y así
en proximidad provocar su efecto terapéutico. Los resultados de este estudio demostraron
la efectividad de los microtejidos de PLA creados por las células terapéuticas, a través de
la disminución del volumen de los tumores. Además, pudimos observar una rápida
vascularización favoreciendo la supervivencia celular.
En conclusión, esta tesis describe la fabricación de microtejidos derivados de células,
sembradas sobre partículas de PLA como estrategia favorable para ingeniería de tejidos,
así como herramienta para la supervivencia y liberación de células terapéuticas en un
modelo anti-tumoral in vivo
