Functional compartmentalization of Rad9 and Hus1 reveals diverse assembly of the 9‐1‐1 complex components during the DNA damage response in Leishmania

Abstract

SummaryThe Rad9‐Rad1‐Hus1 (9‐1‐1) complex is a key component in the coordination of DNA damage sensing, cell cycle progression and DNA repair pathways in eukaryotic cells. This PCNA‐related trimer is loaded onto RPA‐coated single stranded DNA and interacts with ATR kinase to mediate effective checkpoint signaling to halt the cell cycle and to promote DNA repair. Beyond these core activities, mounting evidence suggests that a broader range of functions can be provided by 9‐1‐1 structural diversification. The protozoan parasite Leishmania is an early‐branching eukaryote with a remarkably plastic genome, which hints at peculiar genome maintenance mechanisms. Here, we investigated the existence of homologs of the 9‐1‐1 complex subunits in L. major and found that LmRad9 and LmRad1 associate with chromatin in response to replication stress and form a complex in vivo with LmHus1. Similar to LmHus1, LmRad9 participates in telomere homeostasis and in the response to both replication stress and double strand breaks. However, LmRad9 and LmHus1‐deficient cells present markedly opposite phenotypes, which suggest their functional compartmentalization. We show that some of the cellular pool of LmRad9 forms an alternative complex and that some of LmHus1 exists as a monomer. We propose that the diverse assembly of the Leishmania 9‐1‐1 subunits mediates functional compartmentalization, which has a direct impact on the response to genotoxic stress.

Genome duplication inLeishmania majorrelies on DNA replication outside S phase

“…Furthermore, we show that telomere-proximal replication activity, unlike replication from the core sites, is sensitive to replication stress and depends on RAD9 and HUS1, which are subunits of 9-1-1 complex that acts in the replication stress response pathway (39)(40)(41). Thus, we reveal that two potentially distinct forms of DNA synthesis make up the genome replication programme of L. major, with single putative origins in each chromosome active in S-phase supplemented by subtelomeric DNA synthesis activity outside S-phase.…”

A deficiência das proteínas de checkpoint HUS1 e RAD9 promove a variação do número de cópias no genoma de Leishmania major

“…No entanto, apesar das características conservadas de funcionalidade do complexo 9-1-1 de Leishmania com complexo dos eucariotos superiores, nós encontramos que este complexo na Leishmania apresenta uma divergência significativa como observado no modelamento estrutural de suas subunidades, na qual a estrutura terciária predita da região carboxi-terminal de Rad9 e Rad1 é notavelmente diferente da estrutura cristalográfica para os homólogos de outros eucariotos (Damasceno, Obonaga et al 2016). …”

“…Nós observamos que níveis diminuídos de Rad9 ou Hus1 não só afetam a proliferação, mas também interferem na progressão do ciclo celular, resposta a diferentes tipos de estresse de replicação, drogas que induzem DSB, homeostase dos telomeros e nível de dano no DNA detectado pela histona fosforilada H2A (Damasceno, Nunes et al 2013, Damasceno, Obonaga et al 2016. Curiosamente, as deficiências destas proteínas levaram a fenótipos diferentes e opostos, sugerindo que estas proteínas são requeridas para o apropriado reparo da DSB e que estas subunidades diferem consideravelmente nas suas funções, além da formação do complexo canônico na Leishmania.…”

“…A deficiência de Hus1 levou a seleção de amplificações lineares em baixo número de cópias, enquanto que a deficiência da proteína Rad9 promoveu a seleção de elementos circulares em alto número de cópias. Estes fenótipos característicos poderiam ser explicados pela compartimentalização funcional das subunidades do complexo 9-1-1 reportada previamente por trabalhos realizados em nosso laboratório (Damasceno, Obonaga et al 2016). …”

“…Na análise do perfil e progressão no ciclo celular nós observamos que, na Estes resultados são condizentes com os resultados previamente publicados (Damasceno, Obonaga et al 2016) onde o perfil e a progressão do ciclo celular nestas linhagens foram avaliados após o bloqueio com uma concentração menor de HU e confirmam que a deficiência da proteína Hus1 estaria relacionada com a desregulação da progressão através do ciclo celular após o estresse de replicação, enquanto que a proteína Rad9 poderia ser requerida para promover a progressão no ciclo celular após a liberação do estresse de replicação, como demonstrado por uma progressão mas rápida da linhagem Hus1+/-e uma progressão mais lenta da linhagem Rad9+/-no ciclo celular após o estresse comparadas com a linhagem WT. …”