Forensische DNA-Methylierungsanalyse

Abstract

ZusammenfassungDie quantitative Analyse der relativen DNA-Methylierung gilt als eine der vielversprechendsten Methoden der molekularen Altersschätzung. Viele Studien der letzten Jahre identifizierten geeignete Positionen im Genom, deren DNA-Methylierung sich altersabhängig verändert. Für den Einsatz dieser Methode in der Routine- bzw. Fallarbeit ist es von großer Bedeutung, angewandte Analysetechniken zu validieren. Als ein Teilaspekt dieser Validierung sollte die Vergleichbarkeit der Analyseergebnisse zur DNA-Methylierung mithilfe der Mini- und Pyrosequenzierung zwischen verschiedenen Laboren evaluiert werden. Die Arbeitsgruppe „Molekulare Altersschätzung“ der Deutschen Gesellschaft für Rechtsmedizin (DGRM) führte hierzu den ersten, technischen Ringversuch durch, der 4 Positionen in den Genen PDE4C, EDARADD, SST und KLF14 umfasste. Diese Marker waren in vorangegangenen Studien als altersabhängige Biomarker charakterisiert worden. Am Ringversuch nahmen 12 Labore teil, wobei jedes die Wahl zwischen der Minisequenzierung und/oder der Pyrosequenzierung für die quantitative Methylierungsanalyse hatte. Jedem teilnehmenden Labor wurden Blut- und Speichelproben von 3 Personen unterschiedlichen Alters übersandt. Die Wahl der Reagenzien für die Probenbearbeitung wurde den Teilnehmern freigestellt.Die Ergebnisse der Minisequenzierung zeigten systematische Abweichungen zwischen den Laboren, die am ehesten auf die Verwendung unterschiedlicher Reagenzien und Analyseplattformen zurückzuführen sein können. Die Resultate der Pyrosequenzierung hingegen wiesen nicht auf systematische Abweichungen zwischen den Laboren hin, hier zeigte sich jedoch die Tendenz einer markerabhängigen Abweichung. Darüber hinaus konnten Unterschiede hinsichtlich technischer Probleme zwischen Laboren mit mehr Erfahrung in der jeweiligen Sequenzierungsmethode und Laboren mit weniger Erfahrung festgestellt werden. Sowohl die Beobachtung von systematischen als auch die von markerabhängigen Abweichungen lässt den Schluss zu, dass eine Übertragung von Analysemethoden zwischen Laboren grundsätzlich möglich ist, eine Anpassung des jeweiligen Modells zur Altersschätzung jedoch notwendig sein kann.

Getting the chronological age out of DNA: using insights of age-dependent DNA methylation for forensic DNA applications

“…Although both are based on the measurement of DNAm patterns, the methodology used for age prediction must be more accurate, as changes of 1% of DNAm can be important (e. g., the mean increase in DNAm of the strong-changing marker ELOVL2 is less than 1% per year in middle-aged individuals (Naue et al 2017 )). In particular, to examine the variation obtained by the analysis methods, some studies have examined the differences that arise due to the technology used, and others have examined whether a reliable analysis is performed by different laboratories using the same technology (Freire-Aradas et al 2020 ; Holländer et al 2021 ; Naue et al 2021a ). Freire-Aradas et al analyzed 84 blood samples with Epityper, pyrosequencing, MiSeq and minisequencing, gaining comparable results with the exception of minisequencing.…”

Forensische DNA-Methylierungsanalyse

“…Mithilfe des Assays wurden 5 altersabhängige CpG-Positionen analysiert, wobei das Assay und 4 der 5 Positionen vom 1. RV übernommen wurden [11,18]. Der aktuelle RV wurde um den Marker ELOVL2 erweitert und das Reaktionsvolumen der Multiplex-PCR im Ver- senen Schwankungen bei den anderen Markern im 2.…”

“…Schwankungen zwischen den Laboren und den Methoden haben sich auch im 1. RV gezeigt [11] Bei der Minisequenzierung zeigten sich insbesondere bei PDE4C, EDAR-ADD (Personen 1 und 2) sowie bei ELOVL2 (Personen 1 und 3) höhere absolute DNAm-Schwankungen als bei SST und KLF14 sowie bei Person 2 in ELOVL2 und bei Person 3 in EDARADD mit einem niedrigeren DNAm-Wert. Mit abnehmender Ausgangsmenge an DNA und bei Markern mit einer DNAm um 50 % ist jedoch aus stochastischen Gründen (Binomialverteilung) immer mit höheren Schwankungen zu rechnen [15].…”

“…Dazu wurden im 1. RV eine Auswahl etablierter Marker vorgenommen und ein Assay zur Analyse mithilfe der Minioder Pyrosequenzierung etabliert [11]. Diese Auswahl beinhaltete die Altersmarker EDAR Associated Death Domain (EDARADD), Krüppel-Like Factor 14 (KLF14), Phosphodiesterase 4C (PDE4C) und Somatostatin (SST).…”

“…b Bei Pyrosequenzierung am 5 ′ -Ende biotinyliert cÜbernommen aus[11] d Übernommen von[3] gleich zum 1. RV halbiert.…”