Flow cytometry applications in the evaluation of sperm quality: semen analysis, sperm function and DNA integrity

Cordelli, Eugenia; Eleuteri, Patrizia; Leter, Giorgio; Rescia, Michele; Spanò, Marcello

doi:10.1016/j.contraception.2005.03.004

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“…Se evaluó utilizando el ensayo TU-NEL (In situ Cell Death Detection Kit with fluorescein, Roche®, Mannheim, BW, Germany) descrito por Lopes et al (1998). La integridad del ADN espermático fue evaluado por citometría de flujo al cuantificar la incorporación de dUTP marcado en los sitios de fragmentación del ADN (Cordelli et al, 2005). La suspensión espermática (3 x 10 6 espermatozoides/ml) fue fijada en formaldehido al 4% y permeabilizados en 0,1% Triton X-100 en 0,1% de citrato de sodio.…”

Section: Potencial De Membrana Mitocondrial (∆ψ ∆ψ ∆ψunclassified

Criopreservación de Espermatozoides Caninos a - 80C

2013

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RESUMEN. La congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido (N 2 L) es la técnica más utilizada para preservar el semen de canino y de otras especies domésticas durante largos períodos de tiempo. Este estudio fue diseñado para validar el uso del ultracongelador de -80ºC para congelar y almacenar semen canino en pajuelas. Tres protocolos fueron ensayados (n=10): Control: semen congelado y almacenado en N 2 L; Exp. 1: semen congelado y almacenado -80ºC, y Exp.2: semen congelado a -80ºC y almacenado en N 2 L. Postdescongelación se evaluó por citometría de flujo la viabilidad e integridad de membrana plasmática (SYBR-14/PI), potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm; JC-1), integridad de la membrana del acrosoma (PSA/FITC-PI), translocación de fosfatidilserina (Annexin-V-FITC/PI) y fragmentación del ADN (TUNEL). No se observaron diferencias significativas (P<0,05) entre los grupos Control, Exp.1 y Exp.2 respecto a: integridad de membrana plasmática intacta (42,2 ± 5,3; 35,57 ± 10,3 y 40,76 ± 12,1; respectivamente), ∆Ψm normal (54,7 ± 20,6; 44,4 ± 15,8 y 43,4 ± 15,3 respectivamente), membrana acrosomal intacta (42,9 ± 11,1; 53,2 ± 15,8 y 48,7 ± 20,1 respectivamente) y ADN fragmentado (0,87 ± 0,41; 0,75 ± 0,16; 0,79 ± 0,27 respectivamente). Sin embargo, el promedio de la motilidad progresiva postdescongelación de los grupos E1 y E2 (37,0 ± 4,4%; 36,8 ± 4,1% respectivamente) demostraron diferencias (P<0,05) respecto al grupo Control (55,9 ± 8,7%). Los resultados obtenidos en el presente estudio demostraron que la utilización del ultracongelador de -80ºC para congelar y almacenar espermatozoides caninos tiene un uso potencial en medicina veterinaria como alternativa a la utilización del N 2 L. PALABRAS CLAVE: Canino; Espermatozoide; Congelación; Ultracongelador de -80ºC. INTRODUCCIÓNEn caninos, la congelación y conservación de espermatozoides por periodos prolongados de tiempo se realiza en nitrógeno líquido (N 2 L) (Alamo et al., 2005). Además, han sido utilizadas técnicas alternativas para el procedimiento de congelación como el hielo seco y ultra-congeladores programables para conservar muestras de semen, sin embargo el almacenamiento es en N 2 L (Olar et al., 1989;Hay et al., 1997;Thomas et al., 1993).Ha sido determinada la función espermática en ultracongeladores de -152ºC utilizando parámetros como la motilidad, reacción del acrosoma y morfoanomalías (Ála-mo et al.;Batista et al., 2006). Sin embargo, no existen antecedentes de la utilización del ultracongelador de -80ºC, para congelar semen canino en pajuelas convencionales por periodos cortos como alternativa a la técnica convencional de congelación en N 2 L. En este estudio se evalúa el efecto de la temperatura de congelación y almacenamiento a -80ºC, en comparación al método convencional de congelación y almacenamiento en N 2 L, sobre parámetros esenciales de la función del espermatozoide de canino, tales como motilidad progresiva, funcionalidad de membranas (plasmática, acrosomal y mitocondrial) y fragmentación del ADN. MATERIAL Y MÉTODOAnimales. Se utilizaron...

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Section: Potencial De Membrana Mitocondrial (∆ψ ∆ψ ∆ψunclassified

Criopreservación de Espermatozoides Caninos a - 80C

2013

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“…In the current study, analyzing more than 19 000 spermatozoa from fresh sperm samples with a computer analysis system together with PCA statistics provided enough information to characterize and study the distribution of various morphometric sperm subpopulations in the marmoset. As a consequence, the results obtained in the present study might be useful for biomedical research [18] or could be used as a tool to better understand the sperm variability to preserve the genetic stock from endangered primate species [19]. To date, we are aware of the relationship between the percentage of morphologically normal spermatozoa and fertility, both in human and in other mammals [20 -25].…”

Section: Subpopulationmentioning

confidence: 99%

Sperm head morphometry in ejaculates of adult marmosets (Callithrix jacchus): A model for studying sperm subpopulations and among-donor variations

et al. 2012

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“…Recent developments in flow cytometry methods have enabled more accurate and rapid analysis of sperm attributes in terrestrial and aquatic vertebrates (Gillian et al 2005;Franco et al 2011). A number of sperm characteristics related to fertilizing capacity (viability, acrosomal integrity, mitochondrial function, DNA/chromatin integrity and ROS production) can be accurately and rapidly measured using flow cytometry coupled with fluorescent markers (Cordelli et al 2005, Gillan et al 2005. These measurements have mainly been developed in vertebrates, but very few attempts have been made to apply these methods to the assessment of sperm in bivalves (Adams et al 2003;PaniaguaChavez et al 2006;Favret et al 2010;Haberkorn 2010).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Impact of the toxic dinoflagellateAlexandrium catenellaon Pacific oyster reproductive output: application of flow cytometry assays on spermatozoa

Goïc

Hégaret

Fabioux

et al. 2013

Aquat. Living Resour.

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-The toxic dinoflagellate Alexandrium catenella recurrently blooms on the coasts of France and produces Paralytic Shellfish Toxins (PSTs) that accumulate in bivalves. These toxins can affect various physiological functions including reproduction. The present study aims to validate measurements of sperm viability, DNA content and mitochondrial membrane potential in Pacific oyster Crassostrea gigas using flow cytometry coupled with fluorescent markers, and to use these measurements to assess the cellular parameters of sperm from Pacific oysters exposed to A. catenella. These parameters may influence fertilization, embryogenesis and larval development in free-spawning shellfish. Sperm viability and DNA content estimation were assessed using SYBR-14, which only penetrates cells with intact membranes. Cell mortality was measured with propidium iodide (PI), which penetrates cells with membrane damage. Mitochondrial membrane potential, used as an estimate of mitochondrial function, was measured using JC-1 dye, which selectively enters into mitochondria and reversibly changes colour from green to orange as the membrane potential increases. To assess the effect of toxic algae on oyster sperm, broodstock (ripe oysters) were fed toxic (A. catenella) or non toxic (Heterocapsa triquetra) dinoflagellates at 250 cell ml −1 for 9 days. After this exposure period, mature oysters were stripped and cellular responses of sperm analysed. Average DNA staining, as measured by SYBR-14, appeared lower and more variable in gametes from A. catenella-exposed oysters than in those from control oysters fed H. triquetra. Additionally, mitochondrial membrane potential of sperm from A. catenella-exposed oysters was significantly higher (1.5 fold) than that of sperm produced by oysters fed H. triquetra. Both the increase of mitochondrial membrane potential and the modification of DNA structure can be expected to impact spermatozoa ability to fertilize oocytes and could thus impact related reproductive processes.

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Flow cytometry applications in the evaluation of sperm quality: semen analysis, sperm function and DNA integrity

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Criopreservación de Espermatozoides Caninos a - 80C

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Sperm head morphometry in ejaculates of adult marmosets (Callithrix jacchus): A model for studying sperm subpopulations and among-donor variations

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