Flow Cytometric Immunophenotyping of Cerebrospinal Fluid

Abstract

Leptomeningeal disease is an important adverse complication occurring in patients with B and T cell lymphomas and acute leukemias of lymphoid and myeloid origin. Recent reports suggest that multiparameter flow cytometry immunophenotypic assessment of spinal fluid samples could improve the efficiency of detection of CNS involvement, due to its high specificity and greater sensitivity. However, spinal fluid samples are frequently paucicellular with a rapidly decreasing cell viability. Staining of spinal fluid therefore requires dedicated sample storage/transport, staining, and preparation protocols. The Basic Protocol in this unit outlines a consensus multiparameter (3‐ to 8‐color) flow cytometry immunophenotypic protocol for the evaluation of CNS involvement of cerebrospinal fluid (CSF) samples by neoplastic cells. A Support Protocol describing the simultaneous assessment of surface and cytoplasmic antigens is also provided. Finally, in the Alternate Protocol, we describe a method to calculate absolute numbers of both normal and pathological cell subpopulations by adding counting beads to the assay. Curr. Protocol. Cytom. 45:6.25.1‐6.25.16. © 2008 by John Wiley & Sons, Inc.

Detection and outcome of occult leptomeningeal disease in diffuse large B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma

“…17 The protocol is designed for 3-8 colors, depending on the number of parameters available on the flow cytometer used. The method can be applied to freshly obtained or stabilized samples.…”

Flow cytometric characterization of cerebrospinal fluid cells

“…Apart from differentiating between major leukocyte subsets by assessing granularity and volume of cells, a wide range of cell populations can be specified by immunophenotyping using surface membrane, cytoplasmic, and nuclear antigens (7,14,31). However, intracellular staining should be limited to those cases in which it is essential to reach the immunological conclusion, because its use is associated with relatively pronounced cell loss (31). The number of characteristics on one single cell that can be determined in a single tube depends on the number of fluorescent colors available on the flow cytometer used and the number of monoclonal antibodies per tube.…”

Reporte del Primer Consenso Colombiano de Citometría de Flujo para el estudio de trastornos hematológicos

“…*** Las muestras pueden ser estabilizadas si se requiere confirmar estudios posteriores que no pueden ser practicados durante el tiempo máximo de procesamiento. **** Estudios recientes (22,39) demuestran que el empleo de una solución estabilizante previene la pérdida celular debida a los efectos citotóxicos in vitro del líquido cefalorraquídeo sobre los leucocitos, manteniéndose la eficacia de la estabilización por periodos superiores a las 24-48 horas de su obtención.…”

“…Por el contrario, la citometría de flujo es útil para realizar el recuento de blastos y diferenciar entre las fases crónica, acelerada y de crisis blástica, y para determinar el inmunofenotipo de los blastos en la crisis blástica (mieloide en 60% a 70% de los casos versus linfoide en 20% a 30%) (35). No obstante, la reciente introducción de nuevas herramientas técnicas basadas en la utilización de perlas inmunomarcadas para detectar la proteína de fusión del BCR-ABL, abre las puertas, como nueva prueba muy sensible y específica, para confirmar o descartar con gran rapidez la presencia de la t(9;22) en casos en los que existe una sospecha diagnóstica razonada de leucemia mieloide crónica (39) La citometría de flujo también es útil en la detección de mastocitosis sistémica, relacionada con síndromes mieloproliferativos o con neoplasia mieloide de otro tipo, como leucemia mieloide aguda o síndromes mielodisplásicos, al evaluar la expresión del marcador CD117 para la identificación de los mastocitos en su conjunto, que en las mastocitosis presentan de forma aberrante expresión de CD25 y CD2 (36,37).…”

“…En relación con el equipo humano que trabaja en el área de citometría de flujo, el grupo considera fundamental poder contar con personal con experiencia en las técnicas de marcación con anticuerpos, en el procesamiento de diversos tipos de muestras, en la adquisición del citómetro de flujo que tenga el laboratorio ,y con conocimientos de calibración y compensación del citómetro de flujo (39). También, es indispensable contar con personal que tenga experiencia y conocimientos en relación con la inmunofenotipificación de leucemias y linfomas, y que conozca los algoritmos diagnósticos.…”