Floresans ışımaya bağlı minimal inhibisyon konsantrasyon (MİK) belirlenmesi

Abstract

Özet: Disk difüzyon yöntemi ve mikrodilusyon yöntemini kullanan otomatik sistemler son yıllarda mikrobiyoloji laboratuvarlarının vazgeçilmez parçaları olmuşlardır. Ancak, in vitro ölçüm yapan bu sistemler bakterilerin doğal ortamında değil laboratuvar koşullarındaki hassasiyetlerini ölçmektedirler. Bu çalışmanın amacı antibiyotiklerin etkisinin floresans absorbansın ölçüm yöntemiyle belirlenmesini sağlayacak yöntem geliştirmektir. Bu çalışmada içlerinde floresan ışıma yapan protein içeren bakteriler oluşturmak amacıyla rekombinant plazmidler hazırlanmıştır. Floresans kaynak olarak yeşil floresans protein (GFP) pUC18 ve pAT392 plazmidlerine klonlanmıştır. Elde edilen rekombinant plazmidleri içeren bakterilerde konvansiyonel minimal inhibisyon konsantrasyonu (MİK) ölçümü yapılmıştır. Böylece besi yerindeki canlı hücrelerin yaydığı ışığın ölçülmesi esasına dayanarak alternatif bir MİK ölçüm yöntemi geliştirilmeye çalışılmıştır. Her bir antibiyotik grubu için pUC18-gfp ve pAT392-gfp plazmidlerini içeren ve içermeyen E. coli DH10B bakterisi kullanılmıştır. gfp genini içermeyen bakteriler florometrik ölçüm yapabilen cihazda 24 saatlik ölçüm boyunca ışıma vermemiş grafikleri doğrusal bir ivmeyle izlenmiştir. Ancak sadece canlı hücrelerde ışıma yapabilecek olan pUC18-gfp ve pAT392-gfp plazmidini içeren bakteriler antibiyotiğin hiç uygulanmadığı kontrol grubuna göre oldukça yüksek pik yaptıkları gözlenmiştir. İnhibe edici dozlarda grafik doğrusal bir yapı kazanmıştır. Işımanın alındığı konsantrasyonda en az 10 ışık birimi azalmanın okunduğu yere denk gelen antibiyotik dilüsyonu MİK değeri olarak kabul edilmiştir. Konvansiyonel MİK değerleri ile florometrik MİK değerleri karşılaştırılmış en çok 2 dilüsyon fark saptanmıştır. Işımanın ölçülmesiyle MİK düzeyinin belirlenebileceği bu çalışma ile gösterilmiştir. Geliştirilmeye çalışılan bu yöntem antibiyotiklerin bakterisidal/bakteriostatik etkilerinin saptanmasında, antibiyotiklerin biyofilm içindeki bakterilere etkilerinin gözlenmesinde kullanım potansiyeli vardır. Ayrıca yeni antibiyotik geliştirmede kullanılabilecek basit, ucuz ve kolay bir yöntem adayı olarak denenecek moleküllerin daha hızlı ve etkin şekilde değerlendirilmesini sağlayabilme potansiyeli vardır.