Features of “All LNA” Duplexes Showing a New Type of Nucleic Acid Geometry

Förster, Charlotte; Eichert, André; Oberthür, Dominik; Betzel, Christian; Geßner, Reinhard; Nitsche, Andreas; Fürste, Jens P.

doi:10.1155/2012/156035

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“…7), suggests that the duplex is adopting a structure at least some-what similar to the poly(rA) parallel double-helix. It has been shown that LNA-RNA (i.e., one strand containing all LNA residues, and the pairing strand having all ribose sugars) antiparallel and Watson-Crick paired duplexes adopt a helical conformation with parameters that are unlike RNA-RNA and LNA-LNA antiparallel duplexes, and resemble an intermediate conformation between the two (Eichert et al 2010;Förster et al 2012). Future structural studies are needed to elucidate the helical parameters of a poly( LNA A)-poly(rA) parallel double-helix that we have identified here; it will be interesting and informative to then contrast and compare poly( LNA A)poly(rA) and poly(rA)-poly(rA) parallel helical parameters.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Parallel poly(A) homo- and hetero-duplex formation detection with an adapted DNA nanoswitch technique

Pickard

Brylow

Cisco

et al. 2020

RNA

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Polyriboadenylic [poly(rA)] strands of sufficient length form parallel double helices in acidic and/or ammonium-containing conditions. Poly(rA) duplexes in acidic conditions are held together by A + -A + base-pairing also involving base interactions with the phosphate backbone. Traditional UV-melting studies of parallel poly(A) duplexes have typically examined homoduplex formation of a single nucleic acid species in solution. We have adapted a technique utilizing a DNA nanoswitch that detects interaction of two different strands either with similar or differing lengths or modifications. Our method detected parallel duplex formation as a function of length, chemical modifications, and pH, and at a sensitivity that required over 100-fold less concentration of sample than prior UV-melting methods. While parallel polyriboadenylic acid and poly-2 ′ ′ ′ ′ ′ -O-methyl-adenylic acid homo-duplexes formed, we did not detect homo-duplexes of polydeoxyriboadenylic acid strands or poly-locked nucleic acid (LNA)-adenylic strands. Importantly however, a poly-locked nucleic acid (LNA)-adenylic strand, as well as a poly-2 ′ ′ ′ ′ ′ -O-methyl-adenylic strand, formed a hetero-duplex with a polyriboadenylic strand. Overall, our work validates a new tool for studying parallel duplexes and reveals fundamental properties of poly(A) parallel duplex formation. Parallel duplexes may find use in DNA nanotechnology and in molecular biology applications such as a potential poly(rA) tail capture tool as an alternative to traditional oligo(dT) based purification.

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Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Parallel poly(A) homo- and hetero-duplex formation detection with an adapted DNA nanoswitch technique

Pickard

Brylow

Cisco

et al. 2020

RNA

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“…For example, LNA with 2’fluoro RNA are more stable than 2’OMe RNA counterpart in 10% of foetal bovine serum thus demonstrating their stability [ 17 ]. Interestingly, and in contrast to 2’OMe modifications, multiple LNA residues can be incorporated through the whole oligonucleotides sequence without compromising the base-pairing interaction between the AMOs and the miRNAs [ 16 , 18 ]. This demonstrates that LNAs are one of the most efficient and advanced chemical modification often included in most, if not all miRNA-based oligonucleotide therapies [ 19 ].…”

Section: Design and Chemical Modifications Of Mirna Oligonucleotidesmentioning

confidence: 99%

Pharmacomodulation of microRNA Expression in Neurocognitive Diseases: Obstacles and Future Opportunities

Simion¹,

Nadim²,

Bénédetti³

et al. 2017

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Given the importance of microRNAs (miRNAs) in modulating brain functions and their implications in neurocognitive disorders there are currently significant efforts devoted in the field of miRNA-based therapeutics to correct and/or to treat these brain diseases. The observation that miRNA 29a/b-1 cluster, miRNA 10b and miRNA 7, for instance, are frequently deregulated in the brains of patients with neurocognitive diseases and in animal models of Alzheimer, Huntington’s and Parkinson’s diseases, suggest that correction of miRNA expression using agonist or antagonist miRNA oligonucleotides might be a promising approach to correct or even to cure such diseases. The encouraging results from recent clinical trials allow envisioning that pharmacological approaches based on miRNAs might, in a near future, reach the requirements for successful therapeutic outcomes and will improve the healthcare of patients with brain injuries or disorders. This review will focus on the current strategies used to modulate pharmacological function of miRNA using chemically modified oligonucleotides. We will then review the recent literature on strategies to improve nucleic acid delivery across the blood-brain barrier which remains a severe obstacle to the widespread application of miRNA therapeutics to treat brain diseases. Finally, we provide a state-of-art of current preclinical research performed in animal models for the treatment of neurocognitive disorders using miRNA as therapeutic agents and discuss future developments of miRNA therapeutics.

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“…Dabei ist die Helix im Fall der LNA deutlich gestreckter und breiter. [56] RNA LNA erhöht werden (Tm = 4 -8 °C pro Nukleotid). [47,54,57,58] Ein Grund dafür ist, dass die starre Struktur der LNA auch benachbarte Desoxyribosen in die 3´-endo-Konformation zwingt.…”

Section: Locked Nucleic Acids (Lnas)unclassified

“…Dort ist die Helix deutlich gestreckter und breiter als bei der natürlichen RNA (Abbildung 10). [56,59] In Hybrid-Duplices kann dahingegen eine Mischung beider Strukturen beobachtet werden. [56] Aufgrund dieser strukturellen Unterschiede werden LNAs in Proteinkomplexen schlecht toleriert.…”

Section: Locked Nucleic Acids (Lnas)unclassified

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Adaptormoleküle zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren oder miRNAs an nicht native Bindestellen

Bolz¹

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Die Kontrolle der Genexpression ist eines der großen Ziele der chemischen Biologie. Gemäß dem klassischen Dogma der Molekularbiologe verläuft der Fluss der genetischen Information über die Transkription von DNA zur messenger RNA (mRNA) und durch die Translation von mRNA zu Proteinen. Auch wenn der ursprünglichen Formulierung dieses Dogmas verschiedene Aspekte hinzugefügt wurden, bleibt die Kernaussage unverändert. Eine Störung der Genexpression ist in vielen Fällen die Ursache für schwerwiegende Erkrankungen. Klassische Therapeutika, die im Allgemeinen aus kleinen Molekülen bestehen, können pathogene Proteine spezifisch binden und inhibieren. Allerdings greifen diese Wirkstoffe am Ende der Produktionskette ein und nicht alle Proteine können adressiert werden. Im Gegensatz dazu könnte ein Eingriff auf der Ebene der Transkription oder Translation die Expression der pathogenen Proteine auf ein normales Maß senken oder ganz verhindern. Als entscheidende Regulatoren der Genexpression stellen Transkriptionsfaktoren (TFs) einen interessanten Angriffspunkt zur Kontrolle der Transkription dar. TFs können über den Kontakt zu weiteren Proteinen die RNA Polymerase II rekrutieren und so die Transkription starten. Für die Translation ist die Halbwertszeit der mRNA ein entscheidender Faktor. Die Lebensdauer wird durch eine Vielzahl an Proteinen und micro RNAs (miRNAs) reguliert. MiRNAs sind kurze Oligonukleotide, die in Argonautproteine eingebaut werden können. Die daraus resultierenden RNA-induced silencing complexes (RISCs) sind in der Lage, den Abbau der mRNA einzuleiten. Sowohl TFs als auch RISCs besitzen dabei Nukleinsäure-bindende Untereinheiten, die mit spezifische Sequenzen assoziieren. In gewisser Weise ist die molekulare Erkennung der Nukleinsäuren vergleichbar mit einer Postsendung, die aufgrund der Adresse korrekt zugestellt wird. Um in diesem Bild des täglichen Lebens zu bleiben: Bei einem Wechsel des Wohnorts ist es üblich, einen Nachsendeauftrag zu stellen. Dabei wird die alte Anschrift auf den Postsendungen mit einem neuen Adressetikett überklebt und die Zustellung erfolgt an den neuen Wohnort. Das zentrale Thema dieser Dissertation ist, dieses „Umetikettieren“ auch auf TFs und RISCs zu übertragen. Hierbei ist es notwendig, die Nukleinsäure-bindenden Untereinheiten der Komplexe, also die „alte Adresse“, vollständig zu blockieren und gleichzeitig eine hohe Affinität zu einer neuen Sequenz zu erzeugen. Hierzu könnten bifunktionale Adaptormoleküle verwendet werden. Die Adaptoren für die Rekrutierung von TFs müssen in der Lage sein, sowohl die doppelsträngige DNA (dsDNA) als auch einen TF zu binden (Abbildung I). Dabei sollte eine Selbstbindung des Adaptors vermieden werden. In dieser Arbeit wurde der TF Sp1 als Ziel gewählt, da er an GC-reiche dsDNAs bindet. Dies ermöglicht die Wahl einer AT- oder GA reichen DNA-Sequenz als Ziel der Umleitung, wodurch eine Selbstbindung des Adaptors minimiert werden sollte. Zur Erkennung der DNA war geplant, Pyrrol-Imidazol-Polyamide (PIPs), triplexbildende Oligonukleotide (TFOs) oder pseudokomplementäre PNAs einzusetzen. Für Letztere war es möglich, eine neue Syntheseroute zu einem Fmoc geschützten Thiouracil-Monomer zu entwerfen. Dabei konnte eine selektive Alkylierung an der N1-Position des Thiouracils durchgeführt werden. Auf Basis der PIPs und der TFOs wurden jeweils verschiedene Adaptoren entworfen, deren Bindung zu ihren Zielen mit Band-Shift-Experimenten und im Fall der PIPs zusätzlich mit fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten gezeigt wurde. Im Rahmen dieser Versuche zeigte sich, dass die PIP-basierten Systeme deutlich besser an die Zielsequenzen banden als die TFO-basierten Adaptoren. Das Konjugat K5a besaß hierbei die besten Eigenschaften. Weiterhin konnte mit diesem Adaptor in Pulldown-Experimenten gezeigt werden, dass Sp1 auf eine nicht kanonische AT-reiche Bindestelle umgeleitet wurde. Im Anschluss konnte das Sp1 in Western-Blots detektiert werden. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass K5a in einem HeLa Lysat über mehrere Stunden stabil war und somit eine Anwendung in Zellkulturexperimenten möglich sein sollte. Für die Rekrutierung der RISCs war lediglich eine Erkennung zweier einzelsträngiger RNA-Abschnitte notwendig. Hierzu wurden zwei LNAs oder LNA/DNA-Mixmere verwendet, die über einen Linker verknüpft waren (Abbildung I). Als Folge dieses Aufbaus mussten die beiden Adaptorhälften orthogonal sein, da eine Selbstbindung des Adaptors leichter als bei den TF-Adaptoren auftreten konnte. Diese Adaptoren wurden mit Band-Shift- und fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten auf ihre Fähigkeit, eine Cy5-gelabelte miRNA auf eine Ziel-RNA umzuleiten, überprüft. Es konnte beobachtet werden, dass all-LNA Adaptoren sehr viele off-target-Effekt aufwiesen, welche die Umleitung von miRNAs verhinderte. Im Gegensatz dazu konnten mit DNA/LNA-Mixmeren eine vollständige Umleitung von miRNA-Modellen beobachtet werden. Es war ebenfalls möglich, spezifische RISCs aus HeLa-Lysaten mit unterschiedlichen Adaptoren in Pulldown-Experimenten zu isolieren und in nachfolgenden Western-Blots zu detektieren. Nachdem gezeigt war, dass eine Umleitung in vitro gelang, sollte die Funktion der Adaptoren in Zellkulturexperimenten geprüft werden. Allerdings konnten in diesen Versuchen keine eindeutigen Ergebnisse erhalten werden, sodass die biologische Relevanz der RISC-Umleitung bislang noch nicht bestätigt werden konnte.

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Features of “All LNA” Duplexes Showing a New Type of Nucleic Acid Geometry

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Parallel poly(A) homo- and hetero-duplex formation detection with an adapted DNA nanoswitch technique

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Pharmacomodulation of microRNA Expression in Neurocognitive Diseases: Obstacles and Future Opportunities

Adaptormoleküle zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren oder miRNAs an nicht native Bindestellen

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