Expression of Grapevine leafroll-associated virus 3 coat protein gene in Escherichia coli and production of polyclonal antibodies

Abstract

Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), the main viral species of the grapevine leafroll complex, causes yield and quality reduction in grapes (Vitis spp.). The coat protein gene was RT-PCR-amplified from total RNA extracted from infected grapevine leaves and the amplified fragment was cloned and completely sequenced. The fragment was subsequently subcloned into the pRSET-C expression vector. The recombinant plasmid was used to transform Escherichia coli BL21:DE3 and express the capsid protein. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified by affinity chromatography using an Ni-NTA resin. The identity of the purified protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot. The in vitro-expressed protein was quantified and used for rabbit immunizations. The antiserum was shown to be sensitive and specific for the detection of GLRaV-3 in grapevine extracts in Western blot and DAS-ELISA assays, with no unspecific or heterologous reactions against other non-serologically related viruses being observed.Additional keywords: grapevine, GLRaV-3, recombinant protein, serology, antibodies. RESUMO Expressão da proteína capsidial do Grapevine leafroll-associated virus 3 em Escherichia coli e produção de anticorpos policlonaisGrapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), a principal espécie viral do complexo do enrolamento da folha da videira (Vitis spp.), causa reduções no rendimento e na qualidade da uva. O gene da proteína capsidial foi amplificado via RT-PCR a partir de RNA total, extraído de folhas de videira infectadas. O fragmento amplificado foi clonado e completamente seqüenciado. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-C. O plasmídeo recombinante foi utilizado para a expressão da proteína capsidial em Escherichia coli BL21:DE3. A proteína capsidial, ligada a uma cauda de 6-His, foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Ni-NTA. A identidade da proteína purificada foi confirmada em SDS-PAGE e Western blot e, após quantificação, foi utilizada para imunizar coelhos. O anti-soro mostrou-se sensível e específico para a detecção do GLRaV-3 em extratos de videira por Western blot e DAS-ELISA, não tendo sido observadas reações inespecíficas ou heterólogas contra outros vírus sorologicamente não relacionados.Palavras-chave adicionais: videira, GLRaV-3, proteína recombinante, sorologia, anticorpos.

Produção de antissoro policlonal utilizando a proteína capsidial recombinante do Rupestris stem pitting-associated virus

“…A purificação viral, visando à produção de antissoros, é um processo trabalhoso e, comumente, pode resultar em preparações com pureza e concentrações insatisfatórias, comprometendo a qualidade do antissoro produzido (FAJARDO et al, 2007). Especificamente, em relação à purificação de partículas do RSPaV a partir da videira, dificuldades adicionais são mencionadas: a inexistência de hospedeiras herbáceas para a manutenção e multiplicação deste vírus; a constante presença de complexos virais, com possibilidade muito restrita de isolamento biológico; a característica lenhosa dessa planta e a presença de compostos polifenólicos que se oxidam facilmente; a baixa concentração viral na planta infectada, restrita ao floema.…”

“…Um extrato de proteínas totais de E. coli foi obtido conforme descrito por FAJARDO et al (2007), segundo protocolo não desnaturante. A proteína CP/ RSPaV foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de resina Ni-NTA (Qiagen), conforme instruções do fabricante e avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida e por Western blot (SAMBROOK & RUSSEL, 2001), utilizando-se antissoro comercial (Invitrogen) contra a cauda de seis histidinas da proteína expressada.…”

“…Uma semana após a última imunização, iniciaram-se as nove coletas de sangue (30mL sangria -1 ), realizadas a intervalos também semanais, sendo o sangue processado conforme RADAELLI et al (2008) para a obtenção do antissoro. A purificação da fração IgG foi realizada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-SEPHACEL e quantificada por espectrofotometria (FAJARDO et al, 2007). A sensibilidade e a especificidade do antissoro produzido foram avaliadas em ELISA indireto (RADAELLI et al, 2008), com amostras de videiras sadias ou infectadas por 12 diferentes isolados de RSPaV dos quais oito foram previamente caracterizados molecularmente (RADAELLI et al, 2009;BASSO, 2010).…”

“…Esses resultados são semelhantes aos rendimentos médios de CP recombinantes expressadas para outros vírus de videira (FAJARDO et al, 2007;RADAELLI et al, 2008).…”

“…Diferenças observadas nas sequências de nucleotídeos (nt) ou de aminoácidos deduzidos (aad) do gene da proteína capsidial podem ter efeito sobre as funções desta proteína, incluindo seu relacionamento sorológico, uma vez que alguns epitopos na proteína capsidial são a base para que os anticorpos os reconheçam e possam reagir em ELISA (FAJARDO et al, 2007 …”