Evaluation of HIV–1 derived lentiviral vectors as transductors of Mucopolysaccharidosis type IV a fibroblasts

Puentes-Tellez, María Alejandra; Sánchez, Oscar F.; Rojas-Rodríguez, Felipe; Benincore-Flórez, Eliana; Barbosa, Hector; Díaz, Carlos Javier Alméciga

doi:10.1016/j.gene.2021.145527

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“…In contrast, GM01259 fibroblasts showed a slightly lower recovery than GM00593 and GM01361 fibroblasts, while GM00958 showed the lowest response. A similar observation has been previously reported for GM00958 fibroblasts for several treatments, including PC 64 and lentiviral-based GT 35 . As proposed earlier, our results strongly support the notion of a mutation-dependent response on MPSIVA fibroblasts 35 , 64 .…”

Section: Discussionsupporting

confidence: 89%

“…A similar observation has been previously reported for GM00958 fibroblasts for several treatments, including PC 64 and lentiviral-based GT 35 . As proposed earlier, our results strongly support the notion of a mutation-dependent response on MPSIVA fibroblasts 35 , 64 .…”

Section: Discussionsupporting

confidence: 89%

“…We evaluated the impact of the CRISPR/nCas9 treatment on the total GAGs and lysosomal mass, the major biomarkers of MPS IVA 11 , 35 . We found a normalization in GAGs levels when CRISPR/nCas9 system was delivered with LP to GM00593 and GM01361 fibroblasts.…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

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Delivery and assessment of a CRISPR/nCas9-based genome editing system on in vitro models of mucopolysaccharidoses IVA assisted by magnetite-based nanoparticles

Leal

Cifuentes

Torres

et al. 2022

Sci Rep

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Mucopolysaccharidosis IV A (MPS IVA) is a lysosomal disorder caused by mutations in the GALNS gene. Consequently, the glycosaminoglycans (GAGs) keratan sulfate and chondroitin 6-sulfate accumulate in the lysosomal lumen. Although enzyme replacement therapy has shown essential advantages for the patients, several challenges remain to overcome, such as the limited impact on the bone lesion and recovery of oxidative profile. Recently, we validated a CRISPR/nCas9-based gene therapy with promising results in an in vitro MPS IVA model. In this study, we have expanded the use of this CRISPR/nCas9 system to several MPS IVA fibroblasts carrying different GALNS mutations. Considering the latent need to develop more safety vectors for gene therapy, we co-delivered the CRISPR/nCas9 system with a novel non-viral vector based on magnetoliposomes (MLPs). We found that the CRISPR/nCas9 treatment led to an increase in enzyme activity between 5 and 88% of wild-type levels, as well as a reduction in GAGs accumulation, lysosomal mass, and mitochondrial-dependent oxidative stress, in a mutation-dependent manner. Noteworthy, MLPs allowed to obtain similar results to those observed with the conventional transfection agent lipofectamine. Overall, these results confirmed the potential of CRISPR/nCas9 as a genome editing tool for treating MPS IVA. We also demonstrated the potential use of MLPs as a novel delivery system for CRISPR/nCas9-based therapies.

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Section: Discussionsupporting

confidence: 89%

Section: Discussionsupporting

confidence: 89%

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Delivery and assessment of a CRISPR/nCas9-based genome editing system on in vitro models of mucopolysaccharidoses IVA assisted by magnetite-based nanoparticles

Leal

Cifuentes

Torres

et al. 2022

Sci Rep

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“…Este ensayo ha sido empleado para la evaluación de moléculas pequeñas en la enfermedad de Niemann-Pick [109,110], Tay-Sachs [111] y mucopolisacaridosis IVA [92,112]. De igual forma se ha empleado durante la evaluación de proteínas recombinantes y terapia génica para la mucopolisacaridosis I [113] IVA [91,112] y gangliosidosis GM2 [102,111]. En el presente trabajo, se verificó que los fibroblastos de pacientes MPS IIIB presentan una mayor masa lisosomal con respecto a los fibroblastos WT, similar a lo reportado por Xu y colaboradores mediante epifluorescencia y que el tratamiento a las 48 h con enzima rhNAGLU logra reducir la masa lisosomal como se observa en la microscopia de fluorescencia [108].…”

Section: Discussionunclassified

“…La medición de la masa lisosomal de las células después de tratamiento se evaluó mediante citometría de flujo [91,92]. Para este fin, se sembraron en una placa de 12 pozos fibroblastos de piel con MPSIIIB (GM02931) y fibroblastos gingivales de individuos sanos, y se incubaron por 24 h a 37°C y 5% CO2.…”

Section: Medición De Masa Lisosomalunclassified

Evaluación de la enzima alfa-N-acetilglucosaminidasa humana recombinante obtenida en Komagataella phaffii GS115 en un modelo in vitro de fibroblastos MPS IIIB

Rojas¹

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La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS IIIB), o síndrome de Sanfilippo tipo B, es un trastorno de almacenamiento lisosomal autosómico recesivo causado por deficiencia en la actividad de la enzima lisosomal α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU), provocando la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato (HS). Los pacientes que padecen esta enfermedad presentan principalmente alteraciones a nivel del sistema nervioso central, además de anomalías en otros órganos y tejidos. Actualmente, no existen terapias aprobadas para este trastorno, por lo que diferentes alternativas terapéuticas están siendo evaluadas. La terapia de reemplazo enzimático (TRE) permite la reducción de los sustratos acumulados en el lisosoma a través del suministro de proteínas recombinantes producidas en diferentes sistemas de expresión. La TRE ha sido aprobada para 11 enfermedades lisosomales, para las cuales se han utilizado sistemas de expresión como células de mamífero, plantas y animales. A la fecha, la enzima NAGLU recombinante solo ha sido producida de forma exitosa en células de ovario de hámster chino (CHO). Para el caso de microorganismos como las levaduras aún no se ha obtenido esta enzima recombinante de forma activa empleando este sistema de expresión. Sin embargo, este sistema de expresión ha sido ampliamente usado para la expresión de proteínas de origen humano para terapia, debido a que presenta ventajas como su fácil manipulación y bajo costo de producción, su capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a la proteína nativa humana y la posibilidad de obtener la proteína de forma extracelular, lo cual favorece los procesos de purificación. En el presente estudio se evaluó la producción de la enzima NAGLU recombinante en la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (Pichia pastoris) GS115 como sistema de expresión. La cepa fue transformada con el vector pPICZαA-NAGLU, el cual permite la expresión del gen NAGLU bajo el control del promotor AOX1. La presencia del inserto fue verificada por PCR en diez clones obtenidos en medio suplementado con zeocina. La expresión de la proteína recombinante fue inicialmente evaluada a escala de 10 mL, y aquellos clones que presentaron mayor actividad fueron usados para producir la proteína a escala de 100 mL, escala en la cual dos clones mostraron valores de actividad de 0,074 U/mL y 0,121 U/mL después de 72 horas de inducción. El clon con mejor actividad a 100 mL fue escalado a 400 mL mostrando una actividad de 0,187 U/mL a las 72 horas de cultivo. Finalmente, el extracto crudo fue clarificado a través de diferentes poros de membrana, concentrado y diafiltrado para ser purificado por medio de cromatografía de afinidad. Las fracciones recolectadas mostraron actividades entre 0,195 – 0,242 U/mL, y la presencia de la proteína fue verificada mediante SDS-PAGE y western-blot. Las fracciones fueron desalinizadas, concentradas y diafiltradas en citrato de sodio obteniendo una actividad específica de 0,438 U/mg. Posteriormente, la enzima recombinante NAGLU purificada se usó para realizar ensayos in-vitro empleando fibroblastos de pacientes MPS IIIB. Los resultados mostraron que la proteína fue capturada en un proceso mediado por receptores manosa y manosa-6-fosfato, permitiendo la reducción de la masa lisosomal. Estos resultados representan la primera evidencia de la posibilidad de emplear la levadura K. phaffii como sistema de expresión para la producción de NAGLU humana recombinante, como potencial herramienta para el estudio y continuo desarrollo de una TRE para pacientes con MPS IIIB.

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Iron oxide-coupled CRISPR-nCas9-based genome editing assessment in mucopolysaccharidosis IVA mice

Leal,

Celik,

Fnu

et al. 2023

Molecular Therapy - Methods & Clinical Development

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Evaluation of HIV–1 derived lentiviral vectors as transductors of Mucopolysaccharidosis type IV a fibroblasts

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Delivery and assessment of a CRISPR/nCas9-based genome editing system on in vitro models of mucopolysaccharidoses IVA assisted by magnetite-based nanoparticles

Delivery and assessment of a CRISPR/nCas9-based genome editing system on in vitro models of mucopolysaccharidoses IVA assisted by magnetite-based nanoparticles

Evaluación de la enzima alfa-N-acetilglucosaminidasa humana recombinante obtenida en Komagataella phaffii GS115 en un modelo in vitro de fibroblastos MPS IIIB

Iron oxide-coupled CRISPR-nCas9-based genome editing assessment in mucopolysaccharidosis IVA mice

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