Estudos estruturais e funcionais do regulador transcricional PhoB em >i<Xanthomonas citri>/i<.

Abstract

Xanthomonas citri pv. citri é um fitopatógeno causador do cancro cítrico, doença que afeta diversas espécies de citros. O fosfato inorgânico (Pi), envolvido em diversos processos fisiológicos, necessita de uma fina manutenção dos seus níveis nas células bacterianas ativando genes pertencentes ao denominado Pho regulon. Foi demonstrado anteriormente que ao menos 30 genes pertencentes ao Pho regulon estão presentes em X. citri, incluindo o sistema dois componentes PhoR-PhoB e o sistema de captação de fosfato PstSCAB. PhoR-PhoB é composto de uma proteína sensora quinase (PhoR) que sente às flutuações na concentração do fosfato no meio, ativando a proteína reguladora PhoB que efetuará a regulação positiva da transcrição de genes relacionados à captura e ao metabolismo do fosfato. O presente estudo teve como alvo a caracterização estrutural e funcional da proteína PhoB de Xanthomonas citri, da qual não havia nenhum tipo de informação. Análises de bioinformática mostraram que PhoB de X. citri pertence à subfamília OmpR/PhoB de reguladores de resposta e conserva os motivos funcionais e resíduos essenciais para ativação por fosforilação, associação ao DNA e reconhecimento pela RNA polimerase. A proteína foi expressa solúvel em células de Escherichia coli BL21 (DE3) STAR e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel, seguida por exclusão molecular, na forma monodispersa, estável em pH neutro e, na presença de Mg 2+ , mantém atividade de ligação ao DNA. Ensaios de dicroísmo circular e gel shift, indicaram que PhoB é capaz de interagir com regiões phobox presentes em DNA plasmidiano, com mudanças estruturais que levam ao aumento do conteúdo de estrutura secundária. A conformação avaliada por espalhamento de raio-X a baixo ângulo, confirma a presença de dois domínios unidos por uma junção estreita e flexível, o que dificultou a sua cristalização. Adicionalmente, também avaliamos que houve a ativação das regiões promotoras dos operons pstSCABphoU e oprOphoX, in vitro em meio A com fosfato (indutor do Pho regulon) e in vivo em folhas de Citrus sinensis, sugerindo a ativação de PhoB e sua relevância para o crescimento da bactéria e processo de infecção. Os dados obtidos nesse trabalho, trazem o primeiro conjunto de resultados sobre o regulador PhoB de X. citri, e informações sobre seu mecanismo de ação e ativação durante a infecção in vivo. Devido à alta conservação da proteína no gênero, os resultados podem ser extrapolados para outras espécies. Futuros estudos devem avaliar o papel de PhoB utilizando linhagens mutantes.