Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas

Silva, Ivan Rosa e

doi:10.11606/d.76.2012.tde-22032012-084829

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“…Os números apresentados à esquerda indicam as posições dos resíduos de aminoácidos nas regiões assinaladas, com suas respectivas cores (esses números são indicados em apenas 3 regiões, dado que as outras são simétricas às primeiras). Extraído e modificado de 82 .…”

Section: Caracterização Em Baixa Resolução Por Microscopia De Força Aunclassified

“…Posteriormente, medidas experimentais foram realizadas para a comprovação dessa interação e compreensão da formação do complexo ternário SelA-tRNA sec -SelD e, por fim, compreensão do mecanismo de interação. Todas as etapas dos estudos dessa interação foram realizadas em colaboração com o aluno Ivan Rosa e Silva durante seu projeto de mestrado82 .Como o intuito era determinar a interação de SelD com o complexo binário já montado e, como a estequiometria correta de ligação entre tRNA sec e SelA foi determinada, pode-se realizar a montagem do complexo SelA-tRNA sec previamente, onde uma parcela dos Com essa mesma metodologia foi possível determinar a estequiometria de ligação entre o dímero de SelD com o complexo binário. Titulando-se concentrações crescentes de SelD em uma amostra de 5 µM de SelA-tRNA sec (10 vezes mais concentrada e cerca de 10 Curva estequiométrica.…”

unclassified

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Complexos macromoleculares da via específica de incorporação de selênio de Escherichia coli

Serrão¹

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A existência de uma maior variedade de aminoácidos codificados pelo código genético tem estimado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação desses resíduos nas cadeias polipeptídicas nascentes. Um exemplo é a via de incorporação de selenocisteína evento cotraducional dirigido pelo códon UGA. Em bactérias, essa via conta com uma complexa maquinaria molecular composta por: Selenocisteína Sintase (SelA), Fator de Elongação Específico de Reconhecimento (SelB), Selenofosfato Sintetase (SelD), tRNA específico (SelC ou tRNA sec), sequência específica no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas-SECIS) e Aminoacil tRNA Sintetase (aaRS). Pelo fato do selênio ter uma toxicidade elevada em ambientes celulares, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e razão estequiométrica na formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNA sec , bem como sua caracterização estrutural foram os objetivos deste trabalho. A proteína SelA foi expressa e purificada para utilização em análises envolvendo microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo e em gelo vítreo foram realizadas nos complexos SelA e SelA-tRNA sec , visando obter um modelo estrutural e a razão estequiométrica dos complexos. A fim de compreender o mecanismo de passagem do selênio, ensaios de anisotropia de fluorescência e de microcalorimetria, corroborados pelas análises de troca de hidrogênio-deutério acoplado a espectrometria de massa e espectroscopia de infravermelho, elucidaram a formação e estequiometria do complexo ternário SelA-tRNA sec-SelD. Tentativas de cristalização e análises cristalográficas também foram realizadas, no entanto, sem sucesso. Com os resultados obtidos foi possível propor que o reconhecimento de SelD e, consequentemente, a entrega do selenofosfato, seja uma etapa crucial da via de incorporação de selenocisteínas. Palavras-chaves: Selenocisteína. Complexos macromoleculares. Interação proteína-proteína.

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Section: Caracterização Em Baixa Resolução Por Microscopia De Força Aunclassified

unclassified

Complexos macromoleculares da via específica de incorporação de selênio de Escherichia coli

Serrão¹

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“…33,[115][116] Com relação ao preparo das amostras, SelA foi purificada como descrito anteriormente e os RNAs mostraram-se enovelados da maneira esperada em função da temperatura. 60,[100][101][102][103][104] O novo protocolo de expressão e purificação de SelB permitiu um incremento no valor de concentração de 13 vezes. Somado a isso, foi possível determinar a presença de RNAs e ausência de nucleotídeos endógenos.…”

Section: Análises Das Interações In Vivounclassified

Caracterização das interações macromoleculares das proteínas envolvidas na síntese de selenocisteínas em <i>Escherichia coli</i>

Serrão¹

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“…Uma vez conhecida a sequencia de aminoácidos de uma dada proteína é possível que sejam feitas previsões estruturais (seja sobre a estrutura secundária, terciária ou quaternária, modificações pós-tradicionais e até mesmo possíveis interações com outras proteínas) 17 .…”

Section: Análise Da Proteína Por Meio De Ferramentas De Bioinformáticaunclassified

“…Para efeito de comparação nas propriedades biofísicas entre a proteína clivada e a não clivada foram realizados experimentos de espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a baixo ângulo e espalhamento dinâmico de luz. 17,30 .…”

Section: Caracterização Biofísicaunclassified

Expressão, purificação e caracterização do Leishmania RNA Virus 1-4 e da proteína U5-15k do Tripanosoma brucei

Souza

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O estudo dos protozoários é importante por diversos motivos, entre eles sua diversidade, sua importância evolucionária e impacto na saúde pública. Muitos aspectos tornam o estudo desses seres vivo ainda mais fascinantes, como por exemplo, fenômenos como o transsplincing e a presença de um vírus em algumas espécies de leishmanias. A proteína U5-15k é considerada de grande importância fazendo parte do spliciossoma. Neste trabalho tivemos o objetivo de iniciar a caracterização desta proteína empregando ferramentas de bioinformática para analisar sua sequencia de aminoácidos, sua estrutura secundária e modelar sua estrutura por homologia, também foi possível otimizar sua expressão, purificação, caracterizar sua auto clivagem e fazer estudos biofísicos de Espalhamento Dinâmico de Luz e Espectroscopia de Dicroísmo Circular. O Leishmania RNA vírus 1-4 (LRV1-4) é um vírus da família Totiviridae de capsídeo icosaédrico que codifica duas proteínas (proteína capsidial e RNA polimerase). Sendo pouco estudado tivemos o objetivo de iniciar a caracterização molecular deste vírus com objetivos futuros de empreender estudos estruturais e funcionais. Não foi possível obter expressão recombinante em nenhuma das duas proteínas virais, por isso se optou por se estabelecer um novo protocolo de lise celular e purificação com o qual se obteve imagens inéditas de Microscopia Eletrônica de Varredura, na qual o vírus é purificado ainda envolto em material genético.

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Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas

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Complexos macromoleculares da via específica de incorporação de selênio de Escherichia coli

Complexos macromoleculares da via específica de incorporação de selênio de Escherichia coli

Caracterização das interações macromoleculares das proteínas envolvidas na síntese de selenocisteínas em <i>Escherichia coli</i>

Expressão, purificação e caracterização do Leishmania RNA Virus 1-4 e da proteína U5-15k do Tripanosoma brucei

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