Estudo de proteínas que afetam a tradução mitocondrial em <i>Saccharomyces cerevisiae</i>.

Abstract

Gerais, pelas análises de conservação e correlação de resíduos.À Gisele, sempre muito atenciosa e paciente, por toda a ajuda burocrática.Aos meus amigos e colegas do laboratório: Fernando, Letícia, Bruno, Ana, Janaína, Claudia, Carolina, Erich. Obrigada pela ajuda prática, intelectual e psicológica! Aos meus colegas do fretado, por tornarem mais agradável o trajeto São José dos Campos -São Paulo.Aos meus cunhados Cris e Lu, por me acolherem em sua casa.Às minhas amigas Alessandra, Amanda, Kátia, Milena e Tatiana.Aos meus pais, meu irmão e meu esposo, pela incomensurável ajuda, principalmente em se tratando dos cuidados com os pequenos Gabriel ♥ e Leonardo ♥.Às minhas avós, pelas constantes orações. Uma das razões que fazem de Saccharomyces cerevisiae um organismo modelo é o grau de conservação dos mecanismos celulares que existe entre esta levedura e eucariotos superiores. Porém, mesmo após 21 anos do seqüenciamento do seu genoma, ainda existem mais de 600 ORFs com função desconhecida. Neste trabalho, selecionamos quatro delas para o estudo detalhado. MRPL34 (YDR115w) está presente na subunidade maior do ribossomo mitocondrial de levedura e apresenta similaridade com o gene L34 de E. coli e MRP-L34 de humanos. O mutante ∆mrpl34 apresenta DNA mitocondrial (mtDNA) instável e para estudá-lo foram gerados alelos sensíveis à temperatura (ts). Com os ensaios de síntese protéica mitocondrial in vivo foi possível identificar clara diminuição da síntese de proteínas do mutante condicional. Mrpl34p foi identificada no extrato ribossomal, conforme esperado. A desestruturação da subunidade maior do ribossomo mitocondrial, utilizando os mutantes ts, nos forneceu indícios sobre intermediários existentes no seu processo de montagem. Verificamos que a porção N-terminal da proteína é responsável pelo endereçamento à mitocôndria. YPR116w também apresenta alta instabilidade do DNA mitocondrial, desta forma, mutantes termossensíveis foram utilizados nos experimentos. Uma das estratégias utilizadas visou a busca de parceiros genéticos. Verificamos que ylr091wp aumenta a estabilidade do mtDNA de ts-ypr116w, sugerindo atividade supressora. Também averiguamos que o alelo ts-ypr16w apresenta menor quantidade de tRNA mitocondrial, através de ensaios de Northen blot. Duas das ORFs escolhidas (YDL119c e YOR022c) tiveram sua caracterização inicial publicada em 2016, refletindo a importância deste tipo de pesquisa. Vimos que a proteína codificada por YDL119c está localizada na membrana interna da mitocôndria e que o mutante ∆yor022c apresenta quantidades reduzidas de cardiolipina, quando crescido à 37 o C. One of the reasons that turn Saccharomyces cerevisiae a model organism is the degree of conservation of cellular mechanisms that exist between this yeast and higher eukaryotes. However, even after 21 years of sequencing their genome, there are still more than 600 ORFs with unknown function. In this work, we selected four of them for the detailed study. MRPL34 (YDR115w) is present in the major subunit of the yeast mitochondrial ribosome and...