Estudo da produção e aplicação da enzima extracelular nuclease p1 do fungo Penicillium citrinum Thom 1131 ATCC 14994

Abstract

vi vii RESUMO A enzima nuclease P1 (E.C.3.1.30.1) hidrolisa as ligações éster de RNA na posição 3' liberando 5´nucleotídeos monofosfato (5'AMP, 5'GMP, 5'CMP e 5'UMP). Os nucleotídeos 5'IMP e 5'GMP são encontrados em carne, cogumelos, extrato de levedura e são utilizados como acentuadores de sabor em alimentos como caldo de carne, sopas desidratadas, biscoitos salgados, extratos de peixe, molhos, etc.Foi estudada a fermentação submersa da linhagem de Penicillium citrinum ATCC 14994 visando o aumento da produção da enzima nuclease P1. Na fermentação de Penicillium citrinum em frascos agitados utilizando-se os meios de cultivo descritos por Guo-Qing et. al (2006) e Li et. al (2007 foram obtidos 46,93UmL -1 e 15,47 U mL -1 de nuclease P1, respectivamente.O meio de cultivo descrito por Guo-Qing et. al (2006) foi escolhido como base para os estudos de fermentação e produção de nuclease P1 pela linhagem Penicillium citrinum ATCC 14994. Foram avaliados os efeitos da concentração dos componentes glicose, peptona, farinha de amendoim, K 2 HPO 4 , CaCO 3 e ZnSO 4 do meio de cultura, através de delineamento fatorial incompleto (Plackett Burman) para a seleção das variáveis. Após a seleção das variáveis, foi utilizado um delineamento fatorial completo (DCCR), para os estudos dos efeitos das concentrações de peptona, farinha de amendoim e também quantidade de inóculo e do pH do meio de cultivo na produção de nuclease P1 pelo fungo. Na fermentação de Penicillium citrinum ATCC 14994 nas condições definidas pelos planejamentos experimentais, em frascos Erlenmeyer de 500 mL, utilizando-se 50 mL de meio de cultivo nº3, composto por 3% glicose, 0,5% de farinha de amendoim, 0,2% de peptona, 0,03% de ZnSO 4 e 0,12% de CaCO 3 ajustado para pH 5,3 e 1mL de suspensão contendo 10 8 esporos mL -1 , foi obtido 73,4 UmL -1 , após 72 horas a 28°C e 200 rpm de agitação.Na fermentação da linhagem de Penicillium citrinum ATCC 14994 em biorreator de 5 litros utilizando-se 3 litros de meio nº3, foi obtido 108,9 UmL -1 de viii atividade de nuclease P1, após 96 horas a 30°C, 10v vm e 300rpm. As preparações de nuclease P1 parcialmente purificadas obtidas por a) tratamento térmico a 65°C por 15 minutos, precipitação fracion ada com sulfato de amônia e diálise, e b) tratamento térmico a 65°C por 15 minu tos e ultrafiltração tangencial com membrana orgânica de 30kDa, apresentaram atividade de 634,89UmL -1 e 222,67UmL -1 , respectivamente. A preparação de nuclease P1 obtida por tratamento térmico a 65°C por 15 minutos e ultrafil tração tangencial com membrana de 30kDa, não apresentou a micotoxina citrinina no limite de detecção de 10ppb.A nuclease P1 parcialmente purificada apresentou atividade ótima na faixa de 65 a 70ºC e em torno de pH 5,4 -5,5. A enzima mostrou-se estável até 70ºC após 30 minutos de tratamento térmico em pH 5,4. Após 30 minutos de tratamento térmico a 75ºC e 80ºC em pH 5,4 a enzima reteve respectivamente cerca de 90% e 59% da atividade inicial, sendo inativada completamente após 30 minutos a 90ºC em pH 5,4.No estudo da aplicação da ...