Estandarización de una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para la detección de Strongyloides stercoralis en muestras de materia fecal

Abstract

Introducción: el diagnóstico de estrongiloidiasis se realiza de rutina en los laboratorios clínicos; sin embargo, su detección se dificulta debido a la baja excreción parasitaria y la baja sensibilidad de las pruebas parasitológicas empleadas. Objetivo: diseñar y estandarizar una PCR en tiempo real (qPCR) para la detección de ADN de Strongyloides stercoralis en muestras de materia fecal. Materiales y métodos: se establecieron las condiciones de qPCR y se evaluaron: a) la especificidad analítica mediante análisis BLASTn de secuencias obtenidas de muestras positivas para Strongyloides stercoralis, b) sensibilidad analítica mediante diluciones seriadas de muestras que contenían larvas de Strongyloides stercoralis y c) la ocurrencia de reacciones cruzadas con otros parásitos e inhibidores de la amplificación. Resultados: se amplificó un fragmento de 101 pb del gen 18S del ARN ribosomal. El valor de Ct osciló entre 23 y 29, tomando un Ct ≤35 como el punto de corte para muestras positivas. El análisis BLASTn de las secuencias obtenidas mostró un porcentaje de identidad del 98% con secuencias 18S del ARN ribosomal de Strongyloides stercoralis reportadas en la NCBI. El límite inferior de detección de la qPCR fue 0,9 ng/µL. No se evidenció reacción cruzada con Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Uncinarias, Hymenolepis nana, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Giardia intestinalis e Iodamoeba bütschlii. No se detectaron inhibidores en las muestras de materia fecal. Conclusiones: la sensibilidad y la especificidad analítica de la qPCR comparado con el examen directo de heces son del 100%; sin embargo, aún no es posible interpretar su utilidad clínica.

Strongyloidiasis in humans: diagnostic efficacy of four conventional methods and real-time polymerase chain reaction

“…The threshold cycle (Ct) value obtained with the standardized qPCR was less than or equal to 29.99 in the positive samples. A Ct value between 30.00 and 34.99 was considered indeterminate, assuming that only samples with a very low parasitic load would show those values 27 .…”

Quantitative detection of cassava common mosaic virus for health certification of cassava (Manihot esculenta Crantz) germplasm using qPCR analysis

“…Each dilution was carried out with two replicates, two negative controls, and two no-template controls. These dilutions were also compared with end-point PCR to determine the level of LOD between both techniques [ 36 ]. The number of copies of the serial dilutions was calculated with an equation described by Shirima et al [ 37 ].…”