Estandarización de una PCR anidada para la identificación de Lawsonia intracellularis en porcinos

Abstract

Resumen. Introducción: se estandarizó una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa pcr anidada para el diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina causada por la bacteria Lawsonia intracellularis. Métodos: la técnica se basó en la amplificación de una región de 270 pb del gen 16s arnr de Lawsonia intracellularis; para tal fin, se extrajo el adn de la bacteria mediante el kit Purelink Genomic, Invitrogen ® , a partir de 100 muestras de íleon de porcinos provenientes del área metropolitana de Bucaramanga (Santander). Los adn fueron cuantificados por fluorometría y ajustados a una concentración de 20 ng/µL. Se llevó a cabo una primera amplificación de la porción de 319 pb del gen 16s arn con los iniciadores externos: 5'-tat ggc tgt caa aca ctc cg-3' y 5'-tga agg tat tgg tat tct cc-3' . El producto de esta primera amplificación se usó de molde para una segunda reacción, en la que se amplificó una porción interna de 270 pb del gen 16s arn de L. intracellularis, empleando los iniciadores internos específicos: 5'-tta cag gtg aag tta ttg gg-3' y 5'-ctt tct cat gtc cca taa gc-3' . Las condiciones óptimas para las pcr tanto con los iniciadores internos como con los externos incluyeron: 2,5 µm de mgcl 2 ; 0,15 µm de cada dntp; 1x de Buffer de reacción; 0,8 µm de cada iniciador; y 2,5 U de Taq polimerasa. Como control positivo tanto en la extracción de adn como en las pcr, se empleó adn bacteriano extraído de la vacuna Enterisol ® (Boheringer Ingelheim ® ). Resultados: las temperaturas óptimas de anillamiento para la pcr simple y anidada fueron de 50 y 55°C, respectivamente. El límite de detección de la técnica fue de 5 fg. Conclusiones: la técnica no evidenció reacción cruzada con Esquerichia coli, ni con Salmonella typhimurium, bacterias con cuadros clínicos semejantes.Palabras clave: cerdos, diagnóstico molecular, ileítis. pcr Standardization to Identify Lawsonia intracellularis in PigsAbstract. Introduction: the nested Polymerase Chain Reaction (pcr) technique has been standardized for the diagnosis of porcine proliferative enteropathy caused by Lawsonia intracellularis. Methods: such technique was based upon amplifying a region of 270 pb of the 16s arnr gene of the Lawsonia intracellularis. For such purposes, a dna sample was taken from the bacteria with a Purelink Genomic kit, Invitrogen ® , from 100 samples of porcine ileum of the metropolitan area of Bucaramanga (Santander). The dna samples were quantified with fluorometry and adjusted to 20 ng/µL concentration. The first amplification of the 319 pb part of the 16s gene was completed with the external initiators: 5'-tat ggc tgt caa aca ctc cg-3' and 5'-tga agg tat tgg tat tct cc-3' . The result of this first amplification was used as a pattern for the second reaction, where the internal part of 270 pb of the 16s arn gene of L. intracellularis was amplified using the specific internal initiators: 5'-tta cag gtg aag tta ttg gg-3' and 5'-ctt tct cat gtc cca taa gc-3' . The optimal conditions for the pcr for both internal and external initiators included 2...

Estandarización y validación de la prueba de pcr anidada para el diagnóstico de especies del género xyleborus (coleoptera: curculionidae: scolytinae)

“…Para establecer el límite de detección se realizaron diluciones seriales con un factor de 10 a partir de las muestras de PCR amplificadas. Así se realizaron diluciones desde 10 -1 hasta 10 -5 (Jiménez et al 2014), que correspondieron a 780 ng/µL (ADN sin diluir) y 0.078 pg/µL, respectivamente.…”