Established tools and emerging trends for the production of recombinant proteins and metabolites in Pichia pastoris

Abstract

Besides bakers’ yeast, the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (also known as Pichia pastoris) has been developed into the most popular yeast cell factory for the production of heterologous proteins. Strong promoters, stable genetic constructs and a growing collection of freely available strains, tools and protocols have boosted this development equally as thorough genetic and cell biological characterization. This review provides an overview of state-of-the-art tools and techniques for working with P. pastoris, as well as guidelines for the production of recombinant proteins with a focus on small-scale production for biochemical studies and protein characterization. The growing applications of P. pastoris for in vivo biotransformation and metabolic pathway engineering for the production of bulk and specialty chemicals are highlighted as well.

Phosphoregulation of the transcription factor Mxr1 plays a crucial role in the concentration‐regulated methanol induction in Komagataella phaffii

“…Owing to their strong methanol-induced gene promoters, methylotrophic yeasts have been used as hosts for recombinant protein production (Cregg et al, 2000;Gellissen, 2000;Yurimoto, 2009). Their unique one-carbon (C1) metabolism and the molecular mechanism for methanol-induced gene expression have been extensively studied for more than 50 years (De et al, 2021;Hartner & Glieder, 2006;Kalender & Çalık, 2020;van der Klei et al, 2006;Ogata et al, 1969;Yurimoto et al, 2011;Yurimoto & Sakai, 2019) (Figure S1a).…”

Produção de L-asparaginase por Pichia pastoris em cultivos descontínuos-alimentados em biorreatores.

“…Esta levedura apresenta ampla aplicação biotecnológica em função de suas inúmeras vantagens, tais como: a sua capacidade de crescer tanto em glicose ou glicerol quanto em metanol, provendo cultivos de alta densidade celular em meio definido; o seu sistema de expressão heteróloga induzido por metanol, que permite a manipulação de genes AOX para a produção recombinante; o mecanismo de repressão / de-repressão dos genes AOX que permite separar crescimento da produção recombinante; a capacidade de realizar modificações pós-traducionais, como glicosilação e formação de pontes dissulfeto; alta produção heteróloga intracelular e extracelular; alta eficiência de secreção; Introdução Geral CAPÍTULO 1 ______________________________________________________________________ 63 genoma bem conhecido e com semelhanças com Saccharomyces cerevisiae; ausência de endotoxinas, de patogenicidade e imunogenicidade humana; e a existência de kits comerciais (CEREGHINO;CREGG, 2000;DE et al, 2021;FERREIRA, 2013;JUTURU;WU, 2018;AHMAD;ZHANG, 2012;VALERO, 2013).…”

“…O terceiro mais aplicado é o PFLD1 que codifica a formaldeído-desidrogenase e é um promotor forte e induzido por metanol ou metilamina. Quando é almejada a expressão moderada, podem ser usados os promotores PPEX8 que resulta na produção de enzimas do peroxissomo em glicose ou metanol, ou o promotor do gene YPT1 que leva codifica uma purina hidrolase em glicose, metanol ou Introdução Geral CAPÍTULO 1 ______________________________________________________________________ 66 manitol (CEREGHINO;CREGG, 2000;DE et al, 2021;JUTURU;WU, 2018). Outros promotores alternativos foram extensivamente discutidos por Vogl & Glieder (2013).…”

“…No retículo endoplasmático, a sequência sinal é clivada em diferentes fragmentos e, geralmente, proteínas que possuem o peptídeo alfa apresentam quatro aminoácidos adicionais no N-terminal. A adição e o aprimoramento da sequência sinal por meio de ferramentas de biologia molecular é uma das estratégias mais escolhidas para aumentar a produção extracelular (CEREGHINO;CREGG, 2000;DE et al, 2021;JUTURU;WU, 2018).…”

“…Recentemente, há uma tendência pela engenharia metabólica e genéticas das cepas visando ao aumento da produtividade, entre as estratégias adotadas estão: otimização dos códons, ou seja, a substituição de códons raros por mais frequentes em Pichia; o aprimoramento do promotor e do peptídeo sinal; as modificações nas vias metabólicas para melhorar o rendimento de metanol em produtos ou a inserção de novas vias para a produção de subprodutos de interesse, como carotenoides, terpenos, ácido salicílico, e peptídeos antimictrobianos; e a modulação da glicosilação (AHMAD et al, 2014;DE et al, 2021;JUTURU;WU, 2018;PEÑA et al, 2018). Em especial, essa última modificação permitiu a aplicação da Pichia como plataforma de expressão de biofármacos mais sofisticados, como anticorpos monoclonais e eripoetina recombinante, e será detalhada na próxima seção (BERDICHEVSKY et al, 2011;LIU et al, 2018;SOYASLAN;ÇALIK, 2011).…”