Enzymatischer oder In‐vivo‐Einbau von Propargylgruppen in Kombination mit Klick‐Chemie zur Anreicherung und Detektion von Methyltransferase‐Zielsequenzen in RNA

Abstract

Die präzise,transkriptomweite Kartierung von m 6 A-Positionen, einer der häufigsten internen Modifikationen in eukaryotischer mRNA, ist von großem Interesse.E ine Polymerase-basierte Detektion von m 6 Ai st schwierig, da die Modifikation keinen Einfluss auf die Watson-Crick-Basenpaarung hat. Ein chemisch-biologischer Ansatz wurde entwickelt, der die präzise Kartierung von Zielsequenzen von Methyltransferasen (MTase) durch Einbau einer bioorthogonalen Propargylgruppe in vitro und in Zellen ermçglicht. Die Propargylgruppe wird hierbei enzymatisch von Wildtyp-METTL3-METTL14 angebracht. Nach Biokonjugation und Reinigung brichtd ie reverse Transkription an den m 6 A-Positionen in 65 %der Fälle ab.Dies ermçglicht die Detektion der METTL3-METTL14-Zielsequenzen durchS equenzierungsmethoden der nächsten Generation. Der metabolische Einbau von Propargylgruppen in MTase-Zielsequenzen gelang auch in vivo mithilfe von Propargyl-l-selenohomocystein;s o konnten bekannte rRNA-Methylierungsstellen validiert werden.

Enzymatic Generation of Double‐Modified AdoMet Analogues and Their Application in Cascade Reactions with Different Methyltransferases

“…As non‐natural amino acid substrates, the methionine analogues ortho ‐nitrobenzyl‐ dl ‐homocysteine ( y ‐Hcy) and propargyl‐ l ‐selenohomocysteine ( z ‐SeHcy) were tested (R 3 , Figure 1B). They show unique functional properties and can be used for different downstream applications related to the fields of photochemistry ( y ‐Hcy) [2d] and click chemistry ( z ‐SeHcy) [6b] …”

Selective chemical tracking of Dnmt1 catalytic activity in live cells

“…Previously, AdoMet analog-based profiling of protein methylation targets was described in cell lysates (Sohtome and Sodeoka, 2018), and prototype systems were developed for analysis of histone methylation (Wang et al, 2013) and mRNA adenine-N6 methylation (Hartstock et al, 2018;Shu et al, 2020) in transfected and/or methionine-deprived cells. Here, we present the first engineered mammalian system that enables activity-based chemical tracking of a specific DNA methylating enzyme in live cells under nearly native conditions.…”

“…Here, we also demonstrate that electropermeabilization can be used for efficient delivery of exogenous positively charged compounds into mammalian cells with no apparent size limitation. Metabolic in-cell production of AdoMet analogs has been proven for short transferrable groups (3 carbon atoms) and can generally be achieved under conditions of methionine deprivation (Hartstock et al, 2018;Shu et al, 2020). The latter may lead to dramatically altered DNA methylation, DNMT expression, and significant phenotypic changes of the stem cells (Shiraki et al, 2014;Jung et al, 2017).…”