Endophytic bacteria in long-term in vitro cultivated “axenic” pineapple microplants revealed by PCR–DGGE

Abstract

In vitro propagated plants are believed to be free of microbes. However, after 5 years of in vitro culture of pineapple plants, without evidence of microbial contamination, the use of culture-independent molecular approach [classifying heterogeneous nucleic acids amplified via universal and specific 16S rRNA gene by polymerase chain reaction (PCR)], and further analysis by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) revealed endophytic bacteria in roots, young and mature leaves of such plants. The amplification of 16S rRNA gene (Bacteria domain) with the exclusion of the plant chloroplast DNA interference, confirmed the presence of bacterial DNA, from endophytic microorganisms within microplant tissues. PCR-DGGE analysis revealed clear differences on bacterial communities depending on plant organ. Groupspecific DGGE analyses also indicated differences in the structures of Actinobacteria, Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria communities in each part of plants. The results suggest the occurrence of a succession of bacterial communities colonizing actively the microplants organs. This study is the first report that brings together evidences that pineapple microplants, previously considered axenic, harbor an endophytic bacterial community encompassing members of Actinobacteria, Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria group which is responsive to differences in organs due to plant development.

Antibioticoterapia em microplantas de abacaxizeiro (Ananas comosus)

“…Muitos são os autores que consideram comunidades endofíticas como crípticas, já que não apresentam sintomas em seus hospedeiros e não são detectadas por técnicas de histoquímica, microscopia e de isolamento. Entretanto, estudos com plantas in vitro indicam a existência de comunidades bacterianas não cultiváveis, as quais só podem ser identificadas por meio de análises moleculares, sendo as mais recentes baseadas no gene 16S rRNA (ABREU-TARAZI et al, 2010).…”

“…O mesmo fato foi observado por ABREU-TARAZI et al (2010) e LEONE (2013), em trabalhos que fizeram uso de tratamentos com combinações de antibióticos em plantas micropropagadas. Eles verificaram, comparativamente, alterações no crescimento das microplantas, sendo, em todos os referidos trabalhos, o tratamento com maiores médias em relação ao crescimento do vegetal, o grupo controle (isento de antibióticos).…”

“…(2010), o transporte em maior escala é controlado por membranas celulares, dependendo, portanto, da natureza química do soluto. Essa queda no crescimento, observada em microplantas de abacaxizeiro submetidas à antibioticoterapia, em relação ao controle, era de se esperar, visto que, de acordo com ABREU-TARAZI et al (2010), o contato direto das raízes com a solução no meio de cultura, provavelmente, favorece a absorção dos antibióticos, o qual pode ter alterado a estrutura e diversidade da comunidade bacteriana endofítica presente nesse órgão e, consequentemente, alterado fenômenos morfológicos exclusivos do sistema radicular das microplantas. Adicionalmente, o autor ressalta que a ação de antibióticos no sistema radicular, dependendo de seu potencial de ação, pode influenciar indiretamente no crescimento da planta como um todo, limitando seu desenvolvimento.…”

“…Trabalhos como o de BATAGIN-PIOTTO (2013) demonstram que a especificidade dessa interação endófito/microplanta vai muito além da espécie, podendo até se tratar de uma especificidade entre clones ou mesmo entre indivíduos do mesmo clone. Além disso, ABREU-TARAZI et al (2010) salientaram que cada microplanta apresenta uma resposta distinta à antibioticoterapia, confirmando, assim, a especificidade dessa interação endófito/ microplanta, bem como os resultados observados no presente trabalho quanto as respostas dos clones a cada antibiótico ou mesmo combinação deles.…”

“…No cultivo in vitro, considera-se que a manifestação de colônias microbianas no meio de cultura, quando não ocorre nos primeiros dias após a introdução do material, não é caracterizada como contaminação, considerando-se o fato de não afetarem o crescimento do vegetal e, muitas vezes, apresentam associações benéficas com ele (ALMEIDA et al, 2005;ALMEIDA et al, 2009;ABREU-TARAZI et al, 2010;BATAGIN-PIOTTO, 2013).…”