Introducción: las bacterias patógenas con mecanismos de resistencia a antibióticos pueden ser adquiridas en las ambulancias cuando se presta un servicio de salud de emergencia. Esta situación puede generar infecciones asociadas al cuidado de la salud. Objetivo: realizar la caracterización fenotípica y el perfil de sensibilidad de bacterias recuperadas en ambulancias APH del municipio de Medellín. Metodología: se realizó un estudio descriptivo durante los años 2017 - 2019 en el que se incluyeron 10 ambulancias de Atención Prehospitalaria (APH) de la Secretaría de Salud de Medellín. Se realizó un muestreo de superficies y ambientes a las ambulancias y al personal de salud de APH (hisopado de manos). Se evaluó la presencia de microorganismos indicadores como mesófilos aerobios, coliformes totales, mohos y levaduras. Adicionalmente se determinó la presencia de microorganismos patógenos como Staphylococcus aureus y Escherichia coli. A las bacterias recuperadas se les realizó identificación fenotípica y pruebas de sensibilidad mediante el Sistema Vitek 2 de Biomérieux®, además se emplearon medios cromogénicos de Biomérieux® para la detección de bacterias con mecanismos de resistencia de importancia clínica. Resultados: el 55,4 % de los aislados bacterianos corresponden a Cocos Gram positivos, 34,5 % a Bacilos Gram positivos y 10,1 % a Bacilos Gram negativos. La distribución por tipo de muestras fue: en los manipuladores, en el ambiente de la cabina y en la camilla predominaron los Cocos Gram positivos, en el botiquín los Bacilos Gram negativos. El principal género recuperado correspondió a Bacillus spp 25,9 %, seguido de Staphylococcus spp 22,3 %. A excepción de Stenotrophomonas maltophilia no se recuperaron bacterias con mecanismos de resistencia de importancia clínica. Conclusión: si bien no se recuperaron bacterias con mecanismos de resistencia de importancia clínica, la presencia de Stenotrophomonas maltophilia, bacteria intrínsecamente resistente a los antibióticos, y asociada con infecciones hospitalarias, sugiere que es necesario evaluar los procesos de desinfección detalladamente y continuar con la vigilancia epidemiológica de los microorganismos presentes en las ambulancias.