Latar Belakang: Puskesmas merupakan salah satu fasilitas kesehatan yang wajib melaksanakan Rekam Medis Elektronik (RME) paling lambat 31 Desember 2023 melalui Permenkes Nomor 24 Tahun 2022 tentang Rekam Medis. Namun, faktor kesiapan SDM menjadi tantangan dalam pengimplementasiannya, seperti kurangnya pengetahuan dan skill komputer.Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui faktor dan hambatan yang mempengaruhi kesiapan tenaga kesehatan dalam menerapkan RME di Puskesmas.Metode: Penelitian mixed-method dengan model sequantial explanatory dilakukan pada Mei sampai Oktober 2023 di 23 Puskesmas Kota Padang. Tahap penelitian kuantitatif dilakukan secara cross-sectional terhadap 69 sampel, yaitu dokter, perekam medis, dan perawat. Penelitian kualitatif dilakukan terhadap 46 informan, yaitu 23 kepala puskesmas dan 23 perekam medis dengan cara purposive sampling.Hasil: Dari 69 responden, hanya 33 (47,8%) dengan 39,4% diantaranya adalah perekam medis yang siap menggunakan RME. Tingkat pendidikan, pengalaman kerja, pengetahuan, dan persepsi mempengaruhi signifikan terhadap kesiapan tenaga kesehatan melaksanakan RME. Penyebab belum siapnya tenaga kesehatan dalam melaksanakan RME adalah pelatihan RME tidak diberikan ke seluruh tenaga dan kurangnya keterampilan komputer dan pengetahuan tentang RME.Kesimpulan: Tidak semua tenaga kesehatan siap menerapkan RME karena pelatihan hanya didapat oleh perekam medis sehingga perlu pelatihan untuk meningkatkan pengetahuan RME dan meningkatkan keterampilan komputer bagi seluruh petugas yang menggunakan RME dalam pelayanannya.