Einfluss der Pantothenatsupplementierung auf die L‐Valinbildung in C. glutamicum

Abstract

Viele pflanzliche Farb-, Aroma-und Signalstoffe leiten sich von Carotinoiden ab. Der Schlüsselschritt für die Biosynthese dieser Verbindungen ist die regioselektive enzymatische Spaltung des konjugierten Systems, die 1997 erstmals anhand einer carotinoidspaltenden Dioxygenase (CCD) aus Mais beschrieben wurde. Inzwischen sind zahlreiche weitere Enzyme der CCD-Familie hinsichtlich ihrer Funktion in Pflanzen charakterisiert [1]. Die In-vitro-Nutzung dieser Enzymklasse zur Gewinnung natürlicher Farb-und Aromastoffe ist sowohl aus wissenschaftlicher als auch aus wirtschaftlicher Sicht interessant, erfordert jedoch neben einer verbesserten rekombinanten Enzymgewinnung auch ein maßgeschneidertes Reaktionsmedium für die extrem hydrophoben Substrate. Am Beispiel der AtCCD1 aus Arabidopsis thaliana konnte durch den Einsatz von löslichkeitserhöhenden Fusionsproteinen und durch Optimierung der Expressionsbedingungen die Löslichkeit und die Enzymausbeute bei der Expression in Escherichia coli erhöht werden. Außerdem wurde eine Rückfaltungsstrategie für das noch teilweise in Form von Inclusion Bodies vorliegende Enzym entwickelt. Für die Vermittlung der nicht wasserlöslichen Substrate wurden Tensid-Mizellen und Liposomen in wässrigen Systemen eingesetzt und dabei eine bis zu dreifache Aktivierung des Enzyms in Gegenwart von wassermischbaren Cosolventien beobachtet. Da speziell die tensidbasierten Systeme photometrisch vermessbar sind, wurde zur Charakterisierung von AtCCD1 ein Miktrotiterplatten-Assay entwickelt. Das mizellare System wurde erfolgreich auf einen Enzymreaktor übertragen, in dem die Reaktion auch über eine Sauerstoffzehrungsmessung verfolgt und eine hohe Stabilität des Enzyms beobachtet werden konnte. Für die erfolgreiche Entwicklung biotechnologischer Prozesse ist es essenziell, den Stoffwechsel ausgehend vom Substrat gezielt in die Richtung des gewünschten Produktes zu lenken. Ziel der durchgeführten Versuche war es, bei der Fermentation des für Pantothenat auxotrophen Stammes C. glutamicum DilvA DpanB [1] durch die gezielte Zugabe von Pantothenat die Stoffflüsse in Richtung Valin zu lenken. In Abhängigkeit von der zugesetzten Menge Pantothenat verschiebt sich das Spektrum extrazellulärer Metabolite und die Verteilung des eingesetzten Kohlenstoffs: Bei geringen Pantothenatkonzentrationen werden bevorzugt Metabolite in direktem Zusammenhang mit Pyruvat gebildet (Acetat, Alanin sowie Pyruvat selbst). Der Anteil dieser Metabolite sinkt sukzessive mit steigenden Pantothenatmengen, parallel steigt der Anteil des gebildeten CO 2 (s. Abb.). Überraschenderweise bleibt die Valinbildung konstant. Die Analyse des Metaboloms bei Experimenten im Schüttelkolben zeigt z. B. signifikant höhere Pyruvatpools bei geringeren Mengen an zugesetztem Pantothenat. Mit kleineren Mengen an vorgelegtem Pantothenat steht vermutlich weniger Coenzym A zur Verfügung, um den Stofffluss von Pyruvat über den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA zu katalysieren. Der Anteil des segregierten Valins wird durch die Verfügbarkeit von Pantothena...