Durante o monitoramento de ensaios de biodegradação com consórcios microbianos recuperados de amostras de petróleo do campo Pampo Sul, Bacia de Campos, RJ, observou-se a produção de substâncias exopoliméricas (EPS) a qual ocorria independentemente do processo de biodegradação. Para potencializar essa produção utilizou-se um meio mineral enriquecido com glicose e 9,10-di-hidrofenantreno, n-nonadecano, ácido nonadecanóico, petróleo levemente biodegradado (P1) e petróleo severamente biodegradado (P2) como fontes de carbono. A análise dos EPS por infravermelho e espectrometria de massas com ionização por electrospray (MS-ESI) revelou uma mistura de isoformas de surfactina, que reduziu a tensão superficial da água e do meio Zinder de 72,4 e 55,7 para 28,6 mN m −1. Além disso, demonstraram capacidade de formar emulsões de diferentes óleos em água, com resultados até melhores que de surfactantes comerciais, como Tween 80. A produção dos EPS não foi inibida por nenhum dos substratos testados.Microbial consortia recuperated of crude oil samples from the Pampo Sul field, Campos Basin, RJ, produced biosurfactants in mineral media containing glucose and 9,10-dihydrophenantrene, n-nonadecane, nonadecanoic acid, slightly biodegraded crude oil (P1) or heavily biodegraded crude oil (P2) as carbon sources. The production of exopolimeric substances (EPS) and petroleum biodegradation do not necessarily occur simultaneously. The EPS analyses by infrared and eletronspray ionization mass spectrometry (ESI-MS) revealed a mixture of surfactine isoforms. The biosurfactants reduced the surface tension of water and Zinder medium from 72.4 and 55.7 to 28.6 mN m −1 . Additionally, this surfactant emulsified different oils in water with performances similar to or better than of a conventional surfactant, Tween 80.