Effect of Host Passage on dsRNAs of Two Strains of Citrus Tristeza Virus

Jarupat, T.; Dodds, J. A.; Roistacher, C. N.

doi:10.5070/c56q18393v

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“…Esta técnica se utilizó para analizar variabilidad de aislamientos de CTV a campo (Guerri et al, 1991) o detectar cambios luego de la transmisión por injerto o áfidos a un nuevo hospedador (Albiach-Martí, 1995;Moreno et al, 1991). El estudio de los patrones de dsRNA es sencillo y rápido pero tiene una serie de limitaciones: los patrones varían según la época del año y el hospedante empleado (Jarupat et al, 1988, no necesariamente existe correlación entre los patrones de dsRNA y las características biológicas del aislamiento (Moreno et al, 1990) y a campo los patrones de dsRNA muestran una fuerte variación estacional, por lo cual debe estandarizarse el momento de la toma de muestra si se quiere obtener un perfil completo de dsRNA (Dodds et al, 1987b;Moreno et al, 1990). Estudios posteriores demostraron, además, que algunos de los dsRNAs más abundantes, utilizados para caracterizar a los aislamientos virales, son formas replicativas de moléculas de RNAs defectivos (Moreno and Guerri, 1997).…”

Section: I8 A)unclassified

Análisis de variabilidad molecular de aislamientos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV)

Gago Zachert

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La tristeza de los cítricos es una de las enfermedades más importantes de estos cultivos debido a su gran impacto económico. El agente causal de la misma es el virus de la tristeza de los cítricos (citrus tristeza virus, CTV), un integrante del género Closterovirus. Este virus se encuentra asociado al floema de la planta, afecta a integrantes de la familia Rutaceae y se transmite por la acción de áfidos vectores y por injerto (Bar-Joseph and Lee, 1989). El genoma viral está constituido por una molécula de RNA de cadena simple (ssRNA) y de polaridad positiva (+). Las partículas virales tienen una morfología filamentosa, muy flexuosa y presentan, como característica distintiva del género, dos proteínas de cubierta dispuestas en forma de cola de víbora de cascabel (rattlesnake) (Agranovsky et al., 1995; Febres et al., 1996; Tian et al.,1999). Los genes que codifican para ambas proteínas se encontraron en todos los Closterovirus estudiados, hecho que sugiere que ambos genes homólogos se originaron por duplicación en un antecesor común de la familia (Dolja etal., 1991). En Argentina, la primera epidemia de la enfermedad se inició en 1930 y produjo, a lo largo de quince años, la muerte de más de diez millones de árboles. Actualmente la enfermedad es endémica y en la región está presente el vector más eficiente del virus, el áfido Toxoptera citrícida. Para evitar la muerte de las plantas, el naranjo dulce se injerta sobre pies tolerantes (trifolio, mandarino cleopatra y limón rugoso, entre otros). Sin embargo, la situación es compleja en el NOA, donde las plantaciones jóvenes de pomelos rojos y rosados se ven afectadas por tristeza. Una de las características de la enfermedad causada por CTV es la amplia variedad de síntomas generados por los distintos aislamientos en las plantas infectadas. La expresión e intensidad de los mismos depende del ambiente, de la especie hospedante y de la severidad del aislamiento viral. Los aislamientos pueden producir decaimiento en plantas constituidas por copas injertadas sobre naranjo amargo (decline), acanaladuras en el tronco (stem pitting) y "amarillamiento" de plantines obtenidos a partir de semilla (seedling yellows) (Garnsey et al., 1987). La observación de los síntomas en plantas indicadoras es una de las formas de caracterizar a los aislamientos de CTV. Existen distintos métodos para el control de CTV y las medidas a tomar dependen de la incidencia del virus en un momento dado, de los vectores presentes, de los aislamientos virales y de las variedades de cítricos cultivadas en cada zona. Los diversos controles sólo son efectivos si se cuenta con métodos adecuados para la caracterización rápida de aislamientos, que permitan identificar plantas infectadas con variantes virulentas para producir su rápida erradicación. En el presente trabajo de tesis se estudió la variabilidad de los aislamientos de CTV desde distintas perspectivas. Por un lado, se realizó el análisis exhaustivo de la variabilidad del gen p27, que codifica para la proteína minoritaria de cubierta viral, que se dispone en uno de los extremos del virión. Este estudio se realizó en aislamientos originarios de distintas regiones citrícolas del mundo y en un grupo seleccionado de aislamientos argentinos. Los resultados obtenidos indican que existe una correlación entre las distintas variantes de secuencia encontradas y la patogenicidad de los aislamientos. Por otro lado, se encontró que, al menos al considerar la secuencia de este gen, los aislamientos sudamericanos forman un grupo diferente a los aislamientos de otras regiones geográficas. La secuenciación de la totalidad de los clones de una biblioteca de cDNA de un aislamiento argentino de CTV, C268-2, permitió establecer que en este aislamiento de campo coexisten variantes con diferentes secuencias nucleotídicas. Por otro lado, pese a que la mayor parte de los cambios son conservativos, también se estarían expresando variantes proteicas para distintos genes virales, especialmente para p13, (de función desconocida) y p23, (con un probable rol regulatorio). Las distintas secuencias presentes en C268-2 presentan valores elevados de identidad nucleotídica con diferentes aislamientos secuenciados presentes en banco de datos. Los resultados obtenidos en ensayos de Southern blot permitieron identificar regiones de los clones de la biblioteca de C268-2 que mostraron un comportamiento característico frente a sondas derivadas de dsRNA de diferentes aislamientos virales. Las sondas sintetizadas a partir de las secuencias de estos fragmentos resultaron útiles para discriminar entre aislamientos débiles, moderados y severos, permitiendo caracterizar de manera rápida a los distintos aislamientos de CTV analizados.

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Section: I8 A)unclassified

Análisis de variabilidad molecular de aislamientos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV)

Gago Zachert

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Characterization of Beet Yellows Closterovirus-Specific RNAs in Infected Plants and Protoplasts

He¹,

Rao²,

Creamer³

1997

Phytopathology®

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Tetragonia expansa plants infected with a California isolate of beet yellows virus (BYV-60) contained multiple BYV-specific RNAs identified by Northern blot hybridization. These RNAs were identified by cDNA probes specific to six open reading frames (ORFs). One genomic RNA and five subgenomic (sg) RNAs representing the p65/p6.4, p64, p24, p22, and p21 ORFs were identified. A probe derived from the 3'-terminal ORF (p21) hybridized to each of the sgRNAs, indicating the RNAs are 3' coterminal. Hybridization with 5'- and 3'-end probes indicated that preparations of BYV particles contained the genomic RNA as well as two additional RNA molecules corresponding in size to the coat protein (CP) sgRNA and an unidentified RNA. A Chenopodium quinoa protoplast system also was used to study BYV replication. The temporal accumulation of BYV-specific RNAs and CP was investigated in protoplasts transfected with purified virion RNA. Accumulation of genomic plus-strand RNA was evident as early as 15 h postinoculation. The development of this protoplast system is significant for studies of closterovirus replication.

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Additional Factors Affecting dsRNA Analysis of Citrus Tristeza Virus

Jaraput¹,

Lee²,

Dodds³

1991

International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010)

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We have investigated factors that may have an effect on dsRNA analysis of citrus tristeza virus (CTV). Storage of bark tissue and purified dsRNA at -20 C for up to at least 4 yr and repeated freezing and thawing of each of them appeared to have no detrimental effect on the quality of dsRNA detected by polyacrylamide gel eletrophoresis. The aqueous phase following phenol extraction could be stored at room temperature or at 4 C with or without ethanol (adjusted to 16.5%) for at least 2 weeks. Buffer saturated phenol which has been kept at room temperature for 2.5 yr was still useful for CTV ds RNA extraction. DsRNA extraction could be done without adding nuclease inhibitors, i.e. bentonite or macaloid. Precipitated dsRNA could be recovered by centrifugation immediately after addition of ethanol and sodium acetate. Hosts which yielded good dsRNAs were Pineapple, Navel, and Valencia sweet orange and the scions of Madam Vinous sweet orange on sour orange rootstock. Shoots from the sour orange rootstock gave poor results. Green bark tissue from the older part of the current shoot usually gave a better result than tissue from the young tender shoot tip and the old brown stem from previous flushes. DsRNA results were least acceptable in the summer from various well infected screenhouse grown citrus species.

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Effect of Host Passage on dsRNAs of Two Strains of Citrus Tristeza Virus

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Análisis de variabilidad molecular de aislamientos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV)

Análisis de variabilidad molecular de aislamientos del virus de la tristeza de los cítricos (CTV)

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Additional Factors Affecting dsRNA Analysis of Citrus Tristeza Virus

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