Efectos de herbicidas sobre la diferenciación sexual de <i>Leptodactylus latrans</i>

Abstract

En los últimos años, la expansión de la frontera agrícola de la mano de la “nueva revolución verde” condujo a la adopción de nuevas tecnologías por parte de los productores agrícolas. La fragmentación del hábitat y la contaminación de los recursos por la aplicación de plaguicidas tienen efectos sobre la biodiversidad nativa, afectando sus poblaciones. Los anfibios anuros se encuentran en retroceso numérico y han sido clasificados como organismos bioindicadores de la calidad ambiental. Es conocido que algunos plaguicidas producen efectos en las gónadas de los anfibios, afectando de manera directa su reproducción, aspecto esencial para la supervivencia de las especies. En este contexto, el objetivo del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar el efecto del herbicida glifosato sobre la diferenciación gonadal de Leptodactylus latrans. En el primer capítulo, se desarrolló el estudio de la biología reproductiva de L. latrans con el objetivo de poner a punto el método de inducción artificial de la reproducción en esta especie. Para ello, se realizó un monitoreo continuo durante noviembre de 2013 y febrero de 2016, en cinco sitios de estudio previamente seleccionados con escasa perturbación. Con la intención de conocer la variación en las variables e índices morfométricos externos como predictores de la condición reproductiva, se colectaron machos y hembras adultos de L. latrans diferenciando en épocas reproductiva y post-reproductiva. Se registraron longitud hocico-cloaca (LHC), distancia inter-ocular externa (DIOE), diámetro del vientre (DV), peso corporal (PC), peso de la gónada (PG), de los cuerpos grasos (CG) y del hígado (H). Con estas variables, se calcularon los índices de condición corporal (K) = P/LHC3, de condición reproductiva (ICR) = DV/DIOE, gonadosomático (IGS) = (G/P)*100, de cuerpos grasos (ICG) = CG/P, e índice hepatosomático (IHS) = (H/P)*100. Asimismo, y con el objetivo de caracterizar y actualizar algunas condiciones propias del micro-hábitat de desove, así como parámetros de los nidos de espuma en poblaciones locales de L. latrans, se registró la profundidad del agua, forma, diámetro mayor y menor del nido, diámetro del orificio central, volumen del nido y número de huevos por desove (fecundidad). Se colectó un total de 102 individuos, 47 machos y 55 hembras. Los índices morfométricos externos que mostraron diferencias significativas entre hembras en condición reproductiva y post-reproductiva fueron el ICR (p &lt; 0,0001) y el K (p = 0,045); aunque éste último con menor grado de significancia que el primero. De acuerdo a estos resultados, se determinó al valor promedio del ICR en el grupo reproductivo (ICR = 2,53), como el mínimo valor al cual las hembras se encuentran maduras para reproducirse, y en el cual la inducción hormonal de la reproducción podría resultar efectiva. No se observaron diferencias significativas al comparar las variables e índices morfométricos de los machos en condición reproductiva y post-reproductiva (p &gt; 0,005). Se estudiaron un total de 36 nidos de espuma, de los cuales se obtuvo que los mismos son depositados en cuerpos de agua a una profundidad promedio de 10,24 ± 3,91 cm, y una temperatura de 25,61 ± 1,2 °C. Los nidos presentaron distinta morfología, resultando predominante la amorfa (68,75% de ocurrencia). El diámetro mayor promedio fue de 42,77 ± 15,09 cm, y el volumen promedio registrado de 880 ± 775,6 ml. La fecundidad promedio resulto de 23.236 ± 10.874 huevos. Como resultado adicional de los monitoreos, se puede destacar el hallazgo de nidos comunales y la actividad de machos satélite. Si bien el hallazgo de machos satélite ya había sido previamente documentado en esta especie, los nidos comunales representan una novedad para la biología reproductiva de la especie, e incluso para el género Leptodactylus. Con el objetivo de poner a punto el método de inducción hormonal de la reproducción en L. latrans, se realizaron 5 experimentos de inducción, en época estival, con individuos colectados de los sitios de estudio. Se utilizaron para los mismos distintos volúmenes de agua y naturaleza del sustrato, y se varió la utilización o no de un cebado previo a la inyección hormonal, que se realizó de acuerdo al método AMPHIPLEX. Las parejas fueron monitoreadas diariamente 1 a 3 veces por día, durante 96 horas, registrándose como variables biológicas la emisión del canto nupcial, observación de amplexos y presencia de desove o nido de espuma. Asimismo, se registraron variables fisicoquímicas dentro de los tanques reproductivos (temperatura del aire y del agua, concentración de oxígeno disuelto, conductividad, pH). Como resultado, se observó una inducción efectiva en los machos de L. latrans en los experimentos 1, 3 y 4, con una frecuencia de entre el 25 y 100%; mientras que para las hembras resulto efectiva solo en el experimento 4, con una ocurrencia del 25%, observándose un único evento de desove. El ICR de la hembra en que la inducción resultó efectiva fue de 2,67, lo que coincide con el rango de valor promedio de ICR en hembras reproductivas estudiadas en la naturaleza. Las condiciones físico-químicas en el desove coincidieron con las condiciones promedio registradas en la naturaleza (prof: 10 cm, Tagua: 26°C). En resumen, en este primer capítulo, los monitoreos de campo permitieron determinar y actualizar algunas condiciones propias del micro-hábitat de desove, y parámetros de los nidos de espuma, que resultaron de utilidad para poner a punto el método de inducción artificial de la reproducción. El ICR permitió distinguir entre hembras reproductivas y no-reproductivas en L. latrans. Los valores de ICR, permitieron seleccionar hembras en condición reproductiva, resultando en una inducción exitosa en una hembra con ICR en el rango del promedio. Finalmente, estos resultados representan el punto de partida para la puesta a punto de la inducción hormonal de la reproducción en cautiverio. En el capítulo II, se propuso caracterizar el proceso de desarrollo gonadal de L. latrans desde el punto de vista morfológico, e histológico. En ese sentido, fue necesario establecer un método de mantenimiento para la especie en cautiverio. Se realizaron 6 experimentos evaluando distintas densidades, tipos de alimento, frecuencia de alimentación y cantidad de alimento per cápita. Como puntos finales se evaluó la supervivencia, crecimiento y desarrollo. Los resultados indicaron que la mayor supervivencia se observó en las densidades de 5 y 10 individuos/L (id/L) (p &lt; 0,05), mientras que densidades de 1 id/L resultaron con mortalidad a las pocas horas de iniciados los experimentos. El alimento balanceado para peces (Shulet®), en cantidad de 0,04 g/individuo y la frecuencia de alimentación cada 24 horas, fueron las condiciones que mostraron en una mayor supervivencia (p &lt; 0,05). Las condiciones que resultaron en un mayor crecimiento de los individuos fueron el alimento balanceado para peces y una densidad de 5 id/L (p &lt; 0,05), mientras que para el desarrollo, las diferencias se observaron solamente en el factor densidad, con un mayor desarrollo en los individuos mantenidos en la condición de 5 id/L (p &lt; 0,05). Estos resultados permitieron establecer un protocolo de mantenimiento de la especie en cautiverio para llevar a cabo el estudio del desarrollo gonadal desde etapas tempranas del desarrollo, considerando el punto de vista morfológico e histológico. Para tal fin, se realizaron extracciones de porciones de nidos de espuma de L. latrans en los sitios de estudio previamente mencionados. Una vez eclosionadas las larvas, fueron mantenidos bajo condiciones controladas en densidad de 10 Id/L, como alimento se suministró lechuga licuada y alimento balanceado para peces en escamas. La frecuencia alimentaria fue cada 24 h y se realizaron recambios del agua una vez por semana. Una vez que la larvas alcanzaron el estadio 42 de Gosner (Gs42), fueron transferidas a bateas conteniendo un fondo de agua y colocadas en pendiente. A partir de este estadio, se eliminó el suministro de alimento. En el Gs45, los individuos fueron transferidos a cámaras individuales con un fondo de agua, donde permanecieron hasta el estadio de juvenil. En el Gs46 se reanudo la alimentación, suministrando larvas de Tenebrio molitor. Se extrajeron muestras periódicas de larvas con el fin de obtener individuos (N=10) de cada estadio larval. Las larvas extraídas fueron anestesiadas en solución de benzocaína, decapitadas, fijadas en solución Bouin y conservadas en etanol 70°. Previo a la eutanasia se registraron peso, LHC, LT y Gs. Se disecó complejo riñón-gónada, el cual fue procesado mediante técnicas de histología clásica y cortado serialmente. Se procesaron un total de 89 individuos entre los estadios de Gs25 hasta juveniles de 4 semanas post-metamorfosis. A nivel microscópico, se pudo determinar un estado de gónada indiferenciada desde el Gs25 hasta el Gs35 inclusive. A partir del Gs36 comenzó a observarse la delimitación de una región cortico-medular, correspondiéndose con una diferenciación ovárica, mientras que las gónadas que no muestran esta diferenciación permanecieron como gónadas indiferenciadas (testículo presuntivo). En el Gs40 se observó el primer indicio de diferenciación testicular, como una medula de células germinales, sin corteza, que comienzan a agruparse formando cistos. Los lóbulos seminíferos se hacen evidentes en juveniles de 4 semanas post-metamorfosis. En resumen, L. latrans resulto una especie gonocórica con un patrón de diferenciación sexual de tipo “indiferenciado”. La tasa de diferenciación del ovario de L. latrans fue de tipo acelerada, mientras que la tasa de diferenciación testicular fue de tipo retardada. La proporción de sexos observada fue de aproximadamente 50:50, con variaciones en algunos estadios. En el capítulo III se estudiaron los efectos del herbicida glifosato sobre larvas de L. latrans. En tal sentido, se realizaron bioensayos de toxicidad aguda (96 h de exposición) con el objetivo de evaluar los efectos letales y subletales del herbicida Roundup Ultramax (RU) y del glifosato grado técnico (GLY) en larvas de L. latrans en dos estadios del desarrollo, Gs25 y Gs36. Se colectaron nidos de espuma, que fueron mantenidos bajo condiciones controladas hasta alcanzar el estadio requerido para el inicio de los experimentos. Para el Gs25, se evaluaron 23 concentraciones de RU (0,0007-9,62 mg e.a./L) y 7 concentraciones de GLY (3-300 mg/L), más un grupo control. Todos los tratamientos se evaluaron con dos variantes, con y sin alimentación. Para el Gs36, se evaluaron 7 concentraciones de RU (0,37-9,62 mg e.a./L) y 7 de GLY (3-300 mg/L), más un grupo control. Las larvas Gs36 no fueron alimentadas durante el bioensayo. Todos los tratamientos, tanto para Gs25 como Gs36, se evaluaron por cuadruplicado, bajo una densidad de 10 id/L. Como puntos finales se evaluó la mortalidad y actividad natatoria (cada 24 h), crecimiento (LHC), desarrollo (Gs), anormalidades morfológicas e histopatología hepática (a las 96 h). Como resultado, se pudo observar que las larvas Gs25 del bioensayo sin alimentación no superaron las 72 horas de exposición, en ninguno de los tratamientos (incluido el control); por lo que el alimento resulto un factor clave para el desarrollo de los experimentos en L. latrans. Las CL50 a las 24, 48, y 72 h de RU para larvas Gs25 con y sin alimentación no mostraron diferencias significativas (p&gt;0,05), lo que indica que el suministro de alimento no interfiere con la toxicidad del compuesto en los tiempos evaluados. La CL50 (96 h) de RU para larvas Gs25 fue de 3,26 (3,04-3,43) mg e.a./L; mientras que para Gs36 fue de 8,67 (8,12-9,28) mg e.a./L. Asimismo, se observó que en larvas Gs25 la concentración letal incipiente de RU se alcanzó a las 72h de exposición. Por otro lado, el GLY no mostro efectos letales en ninguno de los bioensayos, tanto con larvas Gs25 como Gs36. Finalmente, el formulado RU resulto ligeramente tóxico (clase III), y el GLY como prácticamente no tóxico (clase IV) según categorías de toxicidad para organismos acuáticos de la US EPA. En lo que respecta a los efectos subletales, pudo observarse que para larvas Gs25 el RU indujo aceleración del desarrollo y crecimiento a partir de los 0,007 y 0,37 mg e.a./L, respectivamente. Ambos tipos de efectos también fueron observados en larvas Gs25 expuestas a GLY, a partir de 15 mg/L, ambos. Asimismo, se observaron efectos de anormalidades morfológicas por exposición a RU y GLY en ambos estadios larvales, a partir de los 2,96 mg e.a./L de RU para Gs25 y 2,22 mg e.a./L de RU para Gs36. Por otra parte, para el caso del GLY, las anormalidades se observaron a partir de los 30 mg/L en ambos estadios larvales. A nivel general, las anormalidades observadas fueron la presencia de edemas y anormalidades orales (pérdida de la mandíbula inferior o superior, anormalidades en crestas dentarias y la pérdida de queratodontes). Finalmente, también se observaron efectos en la actividad natatoria en larvas de Gs36 expuestas a RU, a partir de los 5,18 mg e.a./L. Los resultados de la histopatología hepática con larvas Gs36 mostraron un aumento en el número de melanomacrófagos/área en la concentración más baja de RU (0,37 mg e.a./L) y las dos concentraciones más altas de GLY (75 y 300 mg/L). Por otro lado, el número de centros de melanomarófagos/área resulto significativamente elevado en las concentraciones de 0,37 y 0,74 mg e.a./L de RU y en la concentración de 300 mg/L de GLY. Finalmente, se observaron otras patologías hepáticas como la infiltración, congestión y lipidosis en larvas expuestas a ambos compuestos, observándose diferencias significativas a partir de los 2,22 mg e.a./L de RU para la congestión y lipidosis. El aumento MMc y MMC indican un aumento en la actividad fagocitica y un aumento en la actividad citoprotetora de la melanina. Además, MMc y MMC muestran una curva dosis-respuesta no-monótonica y desaparición de efectos a concentraciones de RU elevadas, con aparición de daño hepático. Con el objetivo de explorar los posibles efectos de perturbación endócrina (Ej: alteración en la proporción de sexos) producidas por la exposición de larvas de L. latrans al herbicida RU y a GLY, se realizó un bioensayo de toxicidad con larvas Gs34 a dos concentraciones subletales de 0,37 mg e.a./L de RU y 100 mg/L de GLY, más un grupo control. Todos los tratamientos fueron evaluados por triplicado y bajo una densidad de 10 id/L. El tiempo de exposición fue de 14 días, durante los cuales las larvas fueron alimentadas con alimento balanceado para peces (Shulet®) cada 24 h, previo a la renovación del medio de ensayo. Los puntos finales evaluados fueron crecimiento (LHC y PC), desarrollo (Gs) e histología gonadal (relación sexos), determinándose cuatro estados de diferenciación sexual: Macho, Hembra, Intersexo y gónada indiferenciada. Los resultados no mostraron efectos (p &gt; 0,05) en el crecimiento ni desarrollo de las larvas tratadas respecto al grupo control. En lo que respecta a la relación de sexos por histología gonadal, se pudo observar en el grupo control una relación de sexos 50:50 (macho/hembra), en el grupo tratado con GLY una relación de 40:60 y en el grupo tratado con RU de 30:70. Si bien estos datos no resultaron estadísticamente significativos (p &gt; 0,05), pudo observarse una tendencia a la feminización en los grupos expuestos a glifosato bajo ambas formas, siendo más pronunciado en el caso del RU. Estos resultados podrían ser indicadores de un posible efecto estrogénico por parte del RU y del GLY sobre las larvas de anfibios. En este sentido, sería necesario ampliar los estudios de este trabajo de Tesis, incluyendo las mediciones de la expresión génica de genes obtenidos para su utilización como biomarcadores de diferenciación sexual en ensayos ecotoxicológicos.

Gonadal morphogenesis in the South American toad Rhinella Arenarum (Anura, Bufonidae) unveils an extremely delayed rate of sex differentiation

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