Dynamics of changes in neuronal network morphology and development of mitochondria in mechanically damaged primary neuronal culture

Abstract

Цель исследования. На модели первичной культуры нейронов изучить влияние повреждения (механическая травма) на: 1 - морфологию нейрональной сети и 2 - динамику образования митохондрий в процессе развития культуры. Методика. Развитие первичной культуры нейронов из мозжечка 7-дневных крыс регистрировали с интервалом 20 мин в течение 2,5 нед. со дня посева клеток с помощью системы прижизненной визуализации и анализа IncuCyte ZOOM, снабженной 20х объективом. Изображения сомы индивидуальных нейронов и развитие нейритов записывали в проходящем свете. Образование митохондрий и генерацию в них электрического трансмембранного потенциала (DY) отслеживали с помощью потенциал-чувствительного флуоресцентного зонда TMRM (20 нМ), который непрерывно присутствовал в культуре с момента посадки. Механическую травму мозга моделировали нанесением царапины шириной ~1 мм по монослою клеток спустя 23 ч после посадки. Результаты. Морфологические изменения развивающейся первичной культуры нейронов (суммарная длина нейритов, относительная площадь сомы) характеризуются тремя фазами, отличающимися по кинетике и продолжительности. TMRM влиял на продолжительность и амплитуду фаз, не изменяя их количества. Митохондрии начинали развиваться на 4-е сут. после посадки культуры и увеличение их числа и рост DY завершались после 10-14-х сут. развития культуры. Заключение: Фазы развития митохондрий соотносятся с тремя фазами морфологических изменений культуры в целом. Первые 2-3 сут. после посадки энергообеспечение нейрональной сети происходит, вероятно, за счет гликолиза, поскольку митохондрии не генерируют DY, достаточный для синтеза АТФ. Аксоны из неповрежденной области прорастают в поврежденную зону преимущественно в направлении нейронов, сохранившихся в зоне царапины. The aim of the study was (1) to trace morphological changes in a primary neuronal culture during its development and compare these changes with morphological changes in a mechanically damaged culture, and (2) to elucidate the dynamics of mitochondrial formation in normal and damaged cultures. Methods. The development of a primary culture of neurons from the cerebellum of 7-day old rats was recorded at 20-min intervals for 2.5 weeks starting from the cell seeding day with a IncuCyte ZOOM’s intravital imaging and analysis system equipped with 20x objective lenses. Images of individual neuronal soma and neurite development were recorded in transmitted light. Mitochondrial formation and generation of electrical transmembrane potential (DY) were monitored with a potential-sensitive fluorescent probe TMRM (20 nM), which was continuously present in the culture from the moment of seeding. Mechanical brain injury was modeled by applying an approximately one-mm wide scratch to the cell monolayer at 23 hours after plating. Results. Morphological changes in the developing primary neuronal culture (total length of neurites, relative area of soma) were characterized by three phases with different kinetics and duration. TMRM influenced the phase duration and amplitude without changing the number of phases. Mitochondria began developing on the fourth day after plating. Increases in their number and DY were complete at 10-14 days of culture development. Conclusion. Phases of mitochondrial development were consistent with three phases of morphological changes in the entire culture. During the first 2-3 days following cell plating, the energy supply to the neuronal network was apparently provided by glycolysis since mitochondria did not generate an adequate DY for ATP synthesis. Axons grow from the intact area into the injured zone mainly in the direction of survived neurons in the scratch zone.