Direct qPCR is a sensitive approach to detect Mycoplasma contamination in U937 cell cultures

Abstract

Objective: We aim to directly detect Mycoplasma DNA in a U937 suspension cell culture without using DNA purification. In order to make Mycoplasma contamination monitoring easier, we optimized a commercially available quantitative PCR (qPCR)-based detection kit. We compared the sensitivity of direct qPCR against qPCR with a purified DNA template. Results: Our findings indicate that qPCR worked optimally with a 6 μl sample volume and a 52 °C annealing-extension temperature. We were able to decrease the annealing-extension step time from 60 to 20 s without any major decrease in reaction sensitivity. The total cycle time of optimized direct qPCR was 65 min. The optimized qPCR protocol was used to detect Mycoplasma DNA before and after DNA purification. Our findings indicate that direct qPCR had a higher sensitivity than regular qPCR. Ct levels produced by direct qPCR with 6 μl templates were almost identical to Ct levels produced by regular qPCR with DNA purified from a 60 μl cell culture sample (23.42 vs 23.49 average Ct levels, respectively). The optimized direct qPCR protocol was successfully applied to monitor the elimination of Mycoplasma contamination from U937 cell cultures.

SARS-CoV-2 Direct real-time Polymerase Chain Reaction Testing in Laboratories With Shortage Challenges

“…The direct RT-PCR in the application of DNA viral detection has shown promising results in hepatitis B and Mycoplasma organisms [ 21 , 22 ]. Other studies using direct RT-PCR on detecting viral RNA suggested that the use of PCR enhancers could lead to early RNAase release, which compromises the RNA integrity [ 23 ].…”

Sık Kullanılan Bazı Hücre Hatları için Kalite Kontrol: Mikoplazma Kontaminasyon Tespiti, Sitokrom B ve Sitokrom Oksidaz Alt Birim I Genlerinin DNA Dizi Analizlerinin Gerçekleştirilmesi

“…Mikoplazmalar nispeten esnek hücre zarına sahip, çok küçük organizmalar oldukları için (0,3-1 μm) yaygın olarak kullanılan 0,45 µm mikrobiyolojik filtrelerden geçebilirler ve potansiyel olarak laboratuvardaki tüm kültürlere yayılabilir 20 . Bu organizma hücre fizyolojisi ile ilgili pek çok parametreyi değiştirebilir, bu da kontamine hücrelerle yapılan deneyleri değersiz hale getirir 34 .…”

“…Halihazırda kültüre edilen hücrelerin %10-15'inin mikoplazma ile kontamine olduğu tahmin edilmektedir 19 . Mikoplazma kontaminasyonunun hücre büyümesi, amino asit metabolizması, kromozomal anormalliklerin indüksiyonu, lenfosit aktivasyonunun indüksiyonu veya inhibisyonu, sitokinlerin indüksiyonu veya baskılanması ve hatta sinyal transdüksiyonu üzerinde etkisi vardır ve hücre kültürü çalışmaları açısından önemli bir tehdittir 20,35 . Mikoplazma tespitinde 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve Hoechst işaretleme, PCR, q-PCR ya da kitler sıklıkla kullanılmaktadır [21][22][23] 38 .…”

“…Bu nedenle hücre kültürlerinin sık ve gizli bir kontaminantı olan hücre duvarı bulunmayan mikoplazma hücre kültür çalışmaları için önemli bir tehdittir 14,15,19 . 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve Hoechst işaretleme, Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), q-PCR ya da kit kullanımları mikoplazma tespitinde sıklıkla kullanılmaktadır [19][20][21][22][23][24] .…”