Development of Taqman-Based Real-Time PCR Assays for Diagnostic Detection of Babesia bovis and Babesia bigemina

Abstract

Two TaqMan-based real-time polymerase chain reaction (PCR) assays devised for the detection of two bovine Babesia parasites, Babesia bovis and B. bigemina, were evaluated for their diagnostic utility using cultured parasites and 92 field bovine blood samples collected from cattle living in Brazil. The real-time PCR assays were compared with previously established nested-PCR assays. The detection limits of both B. bovis- and B. bigemina-real-time PCR assays were identical at the value of 2.5 parasites/microL of the infected blood. When 92 field bovine blood samples were tested using the real-time assays, B. bovis-positive signals were observed in 30 samples among 31 B. bovis-positive blood samples in the nested-PCR assay (96.9% sensitivity and 100% specificity), whereas the B. bigemina-real-time PCR assay could detect the parasite from all of 45 B. bigemina-positive blood samples in the nested-PCR assay (100% sensitivity and specificity). The real-time assays using the TaqMan-system can therefore be practically implemented in the epidemiologic survey for bovine babesiosis. Further studies will be necessary to investigate the clinical value of this technique, especially for the quantitative detections of the parasites.

Sığırlarda Babesia bovis ve Babesia bigemina'nın Real-Time PCR ile araştırılması ve izolatların moleküler karakterizasyonu

“…Bu çerçevede sığır babesiosisi'nin moleküler epidemiyolojisinin belirlenmesinde DNA tabanlı teknikler kullanıl-mıştır (1, 8, 15, 19, 34). Bunlardan Real-Time PCR tekniğinin; hızı, sensitivite ve spesifitesi, seçiciliği, hedef patojenin kantitatif belirlenebilmesi ve otomasyona uygun olması gibi nedenlerle avantajlı olduğu belirtilmiştir (8,18). Dünya'da sığır babesiosisi'nin Real Time PCR'la teşhisinde sınırlı sayıda çalışma yapılmıştır (8,18,22,24,36 (%9,3) B.bovis ile enfekte bulunmuştur.…”

“…Bunlardan Real-Time PCR tekniğinin; hızı, sensitivite ve spesifitesi, seçiciliği, hedef patojenin kantitatif belirlenebilmesi ve otomasyona uygun olması gibi nedenlerle avantajlı olduğu belirtilmiştir (8,18). Dünya'da sığır babesiosisi'nin Real Time PCR'la teşhisinde sınırlı sayıda çalışma yapılmıştır (8,18,22,24,36 (%9,3) B.bovis ile enfekte bulunmuştur. Elde edilen bu prevalans oranın Ankara yöresinden bildirilen prevalans oranından (27) düşük ve Burdur yöresindeki orana (27) paralel bulunurken diğer illerinden bildirilen prevalans oranlarından (4,12,31,35) İstatistiksel analiz sonucu ortaya çıkan farklılıkların yörede vektör kene türlerine, yoğunluklarına ve aktivitelerine, sığırların meraya çıkarılmalarına (outdoor) ve/veya çıkarılmamalarına (indoor), hayvan hareketlerine ve sığırların dirençliliğine bağlı olabileceği düşünülmüş-tür.…”

“…Bu amaçla parazit DNA'sından teşhise yönelik moleküler teknolojik yöntemler yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (9). Bu yöntemlerden son yıllarda Real Time PCR yöntemi, duyarlılığının ve özgüllüğünün yüksek olması, eş zamanlı hızlı teşhis ve kantitasyona olanak sağlaması, parazitemiyi göstermesi yanında özellikle rezervuar hayvanların belirlenmesinde sağladığı avantajlar sebebiyle ön plana çıkmıştır (18,22,24).…”

Sığırlarda Babesia bovis ve Babesia bigemina’nın Reverse Line Blotting, Nested PCR ve Real Time PCR Teknikleri İle Karşılaştırmalı Tanısı

“…Ayrıca söz konusu teknik ile mutasyon analizleri ve gen ekspresyonları da hassas bir şekilde belirlenebilmektedir. Son yıllarda sığır babesiosis'inin spesifik teşhisinde de kullanılmaya başlayan 18S rRNA, mitokondrial cytochrome b ve msa2c gibi farklı gen bölgeleri hedef alınarak dizayn edilen spesifik primer ve problar ile Real Time PCR araştırmalarının yapıldığı görülmektedir [14,24,25] . Criado-Fornelio ve ark.…”

“…Ayrıca Nested PCR'da negatif belirlenen 6 örneğin Real Time PCR'da Ct (dR) (Eşik değer siklusu) değerlerinin yüksek olduğu (>40) belirlenmiş ve neticede bu örneklerde paraziteminin oldukça düşük olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmada elde edilen verilere ve diğer araştırmaların [14,25] [14,24,25] bulguları ile uyum gösterdiği belirlenmiştir. Bununla birlikte Ramos ve ark.…”