Development of holistic analytical methods for disease biomarker discovery and the study of drug efficasy in autoimmune disease

Abstract

Ως αυτοάνοσα νοσήματα χαρακτηρίζονται παθοφυσιολογικές καταστάσεις στις οποίες το ανοσοποιητικό σύστημα ενός οργανισμού στρέφεται εναντίων του ιδίου του οργανισμού. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί πάνω από 100 αυτοάνοσες παθήσεις με την ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) να θεωρείται πρότυπο αυτοάνοσο νόσημα εξαιτίας της ξεκάθαρης συμμετοχής του ανοσοποιητικού συστήματος στην εκδήλωση της ασθένειας. Η ΡΑ εκδηλώνεται με πρήξιμο των αρθρώσεων, ανάπτυξη συμμετρικής πολυαρθρίτιδας που προοδευτικά οδηγεί στην καταστροφή του χόνδρου και της οστικής μάζας της άρθρωσης τα όποια προκαλούν σημαντικά προβλήματα κινητικότητας στους ασθενείς. Η διάγνωση της ΡΑ στηρίζεται στη ραδιογραφική απεικόνιση της άρθρωσης σε συνδυασμό με κλινική διερεύνηση για την ύπαρξη κλινικών δεικτών όπως ο ρευματοειδής παράγοντας (RF) και αντισώματα ACPA. Με τα παραπάνω εργαλεία είναι δύσκολη η διάγνωση της ΡΑ σε πρώιμο στάδιο.Στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές στοχευμένης και ολιστικής ανάλυσης μεταβολιτών σε δείγματα ούρων, ορού αίματος και εκχυλισμάτων αρθριτικής άρθρωσης τα οποία συλλέχθηκαν από το πειραματικό μοντέλο ΤG197 ποντικίων με στόχο την ανεύρεση μεταβολιτών που σχετίζονται με την έκφραση της ΡΑ. Αναπτύχθηκε αναλυτική μεθοδολογία (LC-MS) που επέτρεψε την στοχευμένη ανάλυση περισσοτέρων από 100 μεταβολιτών οι οποίοι μετέχουν σε μεταβολικά μονοπάτια όπως η γλυκολιτική οδός, ο κύκλος του κιτρικού οξέος, ο μεταβολισμός νουκλεοτιδίων κ.α. Διερευνήθηκε επίσης η τεχνολογία απόθεσης κηλίδας βιολογικών δειγμάτων προερχόμενων από αίμα και ούρα. Η μελέτη σταθερότητας της παραπάνω τεχνολογίας σε σχέση με την υγρή αποθήκευση δείγματος έδειξε ότι το μεταβολικό προφίλ δεν μεταβάλλεται σημαντικά εντός 24 ωρών αλλά για μεγαλύτερο διάστημα αποθήκευσης ακόμη και σε θερμοκρασίες χαμηλότερες των -20°C το μεταβολικό προφίλ διαφοροποιείται σηματικά από αυτό των δειγμάτων αναφοράς. Η ολιστική ανάλυση δειγμάτων ούρων έδειξε σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ του μεταβολικού προφίλ ασθενών και υγιών ποντικών μεταξύ της 6ης και 11ης εβδομάδος της ηλικίας τους. Η χορήγηση φαρμάκου Remicade μετατόπισε το μεταβολικό προφίλ των δειγμάτων ούρων από αυτό των άρρωστων σε αυτό των υγιών ποντικών μέτά από 3 εβδομάδες θεραπείας. Στεροείδης ενώσεις βρέθηκαν να συμμετέχουν στη διαφοροποίηση του μεταβολικού προφίλ των ομάδων δειγμάτων ούρων ενώ το ιτακονικό όξυ βρέθηκε να σχετίζεται με την έκφραση της ΡΑ μετά από στοχευμένη ανάλυση δειγμάτων ούρων. Ανάλογη διαφοροποίηση του μεταβολικού προφίλ μεταξύ υγιών και ασθενών ποντικών παρατηρήθηκε και στα δείγματα ορού αίματος τόσο στην εβδομάδα 6 όσο και στην εβδομάδα 11 της ηλικίας των ποντικών. Στοχευμένη ανάλυση σε δείγματα ορού αίματος έδειξε αλλαγή των ενδογενών συγκεντρώσεων μεταβολιτών σχετικών με το μεταβολισμό αμινοξέων και του κεντρικού μεταβολισμού άνθρακα. Το ιτακονικό οξύ παρουσίασε ανάλογη μεταβολή με αυτή στα δείγματα ούρων. Προσθήκη ιόντων λιθίου βοήθησε στη καλύτερη θραύση ιόντων λιπιδίων ένω η χρήση της τεχνολογίας κινητικότητος ιόντων βελτίωσε τη χρωματογραφική ικανότητα διαχωρισμού λιπιδίων σε οργανικά εκχυλίσματα αρθριτικής άρθρωσης. Στοχευμένη ανάλυση υδατικών δειγμάτων εκχύλισης της αρθριτικής άρθρωσης ανέδειξε αλλαγές μεταβολιτών σχετιζόμενων με το μηχανισμό την παραγωγή ενέργειας. Από όσο γνωρίζω αύτη είναι η πρώτη φόρα που τεχνολογία στοχευμένης και ολιστικής ανάλυσης μεταβολιτών χρησιμοποιείται στη μελέτη της βιολογίας της ΡΑ όπως αύτη εκφράζεται μέσω το πειραματικού μοντέλου TG197 αλλά και στη μελέτη της απόκρισης του μοντέλου αυτού στην θεραπεία με φάρμακο Remicade.