Development of fluorescently labeled mononucleosomes for the investigation of transcription mechanisms by single complex microscopy

Reversibility of Structural Rearrangements in Mononucleosomes Induced by Ionic Strength

“…Матрицы получали при помощи полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентномеченых праймеров, описанных в предыдущей работе [15]. Выделение и очистку ДНК-матриц проводили, как описано ранее [6,9]. Концентрацию ДНК определяли методом спектрофотометрии.…”

“…Ионы в растворе участвуют как в стабилизации комплексов поликатионных гистонов в коровой области нуклеосомы и снижении электростатического отталкивания соседних витков полианионной ДНК, так и в регуляции ДНК-гистоновых взаимодействий в нуклеосоме [4,5]. Если в состав нуклеосомы ввести две флуоресцентные метки, образующие донор-акцепторную пару, то для изучения деталей ДНК-гистоновых взаимодействий можно использовать метод флуоресцентной микро-скопии одиночных частиц на основе фёрстеровского резонансного переноса энергии (single particle Förster Resonance Energy Transfer microscopy, далее spFRET-микроскопия), который позволяет обнаруживать и характеризовать отличающиеся по структуре субпопуляции нуклеосом, одновременно присутствующие в растворе [4][5][6][7][8][9].…”

“…ДНК-матрица 603 является альтернативой матрице 601 и широко используется в биоинженерных мононуклеосомных системах для изучения процессов транскрипции и взаимодействия с различными ядерными белковыми факторами в солевых буферах на основе KCl [2,6,8,9,12,13]. Структурные перестройки, происходящие в нуклеосомах на основе матрицы 603 (нуклеосомах-603) под действием повышенной ионной силы, и их обратимость не исследовались и требуют изучения.…”

Histone tails promote PARP1-dependent structural rearrangements in nucleosomes

“…Исследование взаимодействий N-и N m -нуклеосом с рекомбинантным PARP1 (получен по методике [10] и любезно предоставлен проф. Паскалем) выполняли с применением методов электрофореза в полиакриламидном геле EMSA (electrophoretic mobility shift assay; методика в [11]), Вестерн-блота и флуоресцентной микроскопии одиночных частиц на основе фёрстеровского резонансного переноса энергии (spFRET-микроскопии; методика в [12]). Формирование нуклеосом N и N m , а также их комплексов с PARP1 (20 нМ) было подтверждено данными электрофореза (рис.…”

“…Нуклеосомы, содержащие флуоресцентные метки в положениях 13 и 91 п.н. от начала последовательности s603 и расположенные на соседних витках сверхспирали ДНК вблизи от её входа в нуклеосому [12], исследовали методом spFRET-микроскопии, как в [6]. Представлены частотные распределения нуклеосом по эффективности FRET (E), измеренные для N-и N m -нуклеосом при взаимодействии с 10 нМ (а) и 20 нМ (б) PARP1.…”