Development of a novel PTT assay for mutation detection in PALB2 large exons and PALB2 screening in medullary breast cancer

Abstract

Beyond BRCA1 and BRCA2 genes, PALB2 (Partner and localizer of BRCA2) emerges as the third breast cancer susceptibility gene due to its role in the same DNA repair pathway: homologous recombination. In most populations studied so far, PALB2 mutations are detected in 1-2% of BRCA negative female patients. PALB2 gene contains 13 exons; exons 4 and 5 consist 65% of the coding area. We developed a protein truncation test (PTT) for quick screening of truncating pathogenic mutations of these two large exons. Specific primers were de novo, in silico designed and the PTT-PCR products were translated in the presence of biotinylated lysine and detected colorimetrically. The assay was initially tested in 30 patients with hereditary breast cancer, negative for BRCA mutations and then, in 17 patients with the rare medullary breast cancer subtype. Small PALB2 exons were screened with high-resolution melting curve analysis (HRMA) and the large DNA rearrangements with multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). Any alterations detected were verified by Sanger DNA Sequencing. The developed PTT methodology is highly specific for clinical significant mutations; positive control samples that produce truncated PALB2 peptides were correctly identified and the method was accurate when compared to DNA sequencing. We did not detect any deleterious PALB2 mutation in both groups of patients. HRMA and MLPA were also negative for all tested samples. However, our novel, fast and cost-effective PTT method for pathogenic mutation detection of the two large PALB2 exons can be applied in screening of a large number of breast cancer patients.

Análise da expressão de RNAs longos não codificantes em tumores metastáticos de câncer de mama

“…Entre os genes relacionados com moderada penetrância familial, tem sido observadas mutações de perda de função no PALB2 em 0,6% a 3,9% das famílias com histórico de câncer de mama (Antoniou et al, 2014). A proteína de PALB2 interage com as proteínas dos genes BRCA1/2, ativando a resposta de reparo do DNA e garantindo que não haja erros durante a recombinação homóloga -a interrupção dessa interação, geralmente devido a mutações, aumenta significativamente o risco de câncer (Poumpouridou et al, 2015). Aos 70 anos, o risco de desenvolvimento do carcinoma de mama em mulheres portadoras de mutação em PALB2 vai de 33%, para mulheres que não possuem parentes afetados, até 58% para mulheres com dois parentes de primeiro grau diagnosticados com câncer de mama aos 50…”

Μελέτη Και Κλινική Αξιολόγηση Νέων Μοριακών Δεικτών Καρκίνου Του Μαστού

“…Η ανάλυση του γονιδίου σε ένα μεγάλο αριθμό από αυτά τα δείγματα θα μπορούσε να γίνει πιο γρήγορα και αποτελεσματικά με τις μέθοδο σάρωσης PTT που αναπτύξαμε στα μεγάλα εξόνια (4 και 5) και με την HRM (High Resolution Melting curve analysis) στα μικρά εξόνια τα οποία αξίζει να αναλυθούν και αυτά περαιτέρω καθώς σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες έχουν βρεθεί παθογνωμικές μεταλλάξεις ακόμη και στο τελευταίο εξόνιο 13 (π.χ. Υ1183Χ), οι οποίες, παρόλο που βρίσκονται πολύ κοντά στο τέλος της πρωτεΐνης έχουν υψηλό σχετικό κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου του μαστού(87,176).Υπάρχει πληθώρα υπολογιστικών προγραμμάτων για την υποβοήθηση της γενετικής συμβουλευτικής σε ασθενείς με κληρονομούμενο καρκίνο μαστού ή/και ωοθηκών ή σε άτομα με υποψία για προδιάθεση για το σύνδρομο αυτό λόγω οικογενειακού ιστορικού ή σε φορείς μεταλλάξεων όπως τα BRCA Risk calculator, BOADICEA(177,178), BRCAPRO, IBIS, FHAT, Penn, Manchester score κλπ καθώς και βιβλιογραφία για τη συγκριτική τους αξιολόγηση(179). Είναι φανερό ότι μελλοντικές εκδόσεις των ανωτέρω προγραμμάτων πρέπει να περιλαμβάνουν επιπλέον στοιχεία πέραν της ηλικίας και του οικογενειακού ιστορικού όπως ο ιστολογικός τύπος και η IHC μελέτη (όταν υπάρχουν τα δεδομένα σε ER, PR, HER2 αλλά και σε άλλους νεώτερους δείκτες όπως το CK14 και CK5/6) αλλά και να συνυπολογίζουν την πιθανότητα ύπαρξης μετάλλαξης και στα υπόλοιπα γονίδια που προδιαθέτουν για καρκίνο μαστού (όπως π.χ.…”

“…Αυτές οι αλλαγές γενικά θεωρούνται πολύ σπάνιες για το PALB2 γονίδιο(40,104). Καμία τέτοια μετάλλαξη δεν ανιχνεύτηκε στα τέσσερα αυτά δείγματα με των συνδυασμών μεθόδων που ελέχθηκε το γονίδιο (MLPA/PTT/HRMA(176)). Η αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας συγκεκριμένων miRNAs θα μπορούσε να ήταν ένας άλλος μηχανισμός για την μείωση της έκφρασης σ' αυτά τα 4 δείγματα π.χ.…”