Development of a multiplex PCR protocol for the detection of several bacteria causing acute diarrhea in pig

Abstract

1Công Ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương, *ntanhbio@gmail.com 2 Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai TÓM TẮT: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình phát hiện ba loài vi khuẩn có khả năng gây tiêu chảy cấp ở lợn bao gồm Salmonella spp., Clostridium perfringens và E. coli ETEC trong bệnh phẩm, phân và mô ruột, dựa trên kỹ thuật multiplex PCR. Các thông số tối ưu cho quy trình bao gồm: nồng độ mồi cho từng đối tượng tương ứng là 350 nM (Salmonella spp.), 200 nM (C. perfringens), 200 nM (E. coli ETEC), 50 nM mồi chứng nội (Porcine β-actin), nhiệt độ lai là 61 o C. Ngưỡng phát hiện của quy trình là 2,510 3 bản sao/phản ứng cho cả ba đối tượng. Quy trình được kiểm tra trên một số mẫu sinh thiết ruột và phân lợn bị bệnh tiêu chảy, kết hợp so sánh với kit thương mại cho thấy có khả năng phát hiện chính xác ba loài vi khuẩn tương đương với kit thương mại với hệ số Kappa tương ứng được xác định là 1,0; 0,45 và 0,56. Quy trình có khả năng phát triển thành một phương pháp chẩn đoán tiện lợi, nhanh chóng, đặc hiệu và chính xác; hơn nữa, có thể được sử dụng như một công cụ nghiên cứu dịch tễ học sự nhiễm những vi khuẩn này trong các quần thể lợn nuôi.Từ khóa: Clostridium perfringens, E. coli, Salmonella, multiplex PCR, bệnh tiêu chảy. MỞ ĐẦUBệnh tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi lợn, gây nhiều tổn thất kinh tế, bệnh đe dọa nhóm lợn sơ sinh dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Ở lợn trưởng thành, bệnh thường tự khỏi nếu được chăm sóc tốt nhưng trong trường hợp lợn mẹ mang mầm bệnh, đàn con có thể bị lây nhiễm, tiêu chảy và tử vong trong thời gian ngắn do không có sức kháng bệnh.Bệnh có thể do vi khuẩn, virus, ký sinh trùng gây ra với triệu chứng tương tự nhau. Trong số các vi khuẩn có khả năng gây tiêu chảy cấp, Clostridium perfringens, Escherichia coli (ETEC) và Salmonella spp. là những đối tượng được quan tâm, chúng được tìm thấy trong những trường hợp lợn bị các bệnh về dạ dày, ruột. Clostridium perfringens là vi khuẩn Gram (+), hình thành bào tử, kị khí, thường có trong đất, nước thải và đường ruột của người và động vật. Clostridium perfringens được chia thành năm typ, từ A đến E, dựa trên khả năng sản xuất bốn loại độc tố là độc tố α (CPA), độc tố β (CPB), độc tố epsilon (ETX) và độc tố iota (IA) [6]. E. coli ETEC (Enterotoxigenic E. coli) là một tác nhân đáng lưu ý bởi tạo ra cả hai loại độc tố ổn nhiệt và nhạy nhiệt, được mã hóa bởi gene ST và LT [10], gây triệu chứng tiêu chảy nghiêm trọng ở lợn mới sinh và lợn cai sữa [2, 3]. Các chủng E. coli không gây bệnh vẫn hiện diện trong đường ruột của động vật khỏe mạnh nên cần phân biệt giữa E. coli và E. coli ETEC [1,5]. Salmonella spp. là một trong những tác nhân gây tiêu chảy phổ biến ở lợn trưởng thành, trong đó, hai chủng Salmonella chủ yếu gây bệnh là S. choleraesuis và S. typhimurium, chiếm hơn 65% tình trạng nhiễm Salmonella ở lợn. Có khoảng 200 gene độc tồn tại ở Salmonella, trong đó gene invA có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của Salmonella vào thể chủ [8,12].Một số công trình nghiên...