Determination of the relative proportion of malt in crushed grain products by RT-PCR and PCR. Part 3

Abstract

Ячменный солод является основным ингредиентом для производства ферментированных напитков, формирующим их вкус, цвет и аромат, а применительно к пиву еще и стойкость и качество пены. Для контроля за соблюдением норматива технического регламента ЕАЭС 047/2018 по допустимому порогу частичной замены пивоваренного солода зерном или продуктами его переработки необходимо создание новых методологических подходов, в том числе на основе молекулярно-генетических методов исследования. Поэтому цель настоящей работы заключалась в разработке способов определения относительной доли ячменного солода в дробленых зернопродуктах методами ОТ-ПЦР и ПЦР. Экстракцию нуклеиновых кислот из пробоподготовленного материала осуществляли коммерческим набором innuPREP Plant DNA Kit по рекомендованному производителем протоколу 2. Постановку ОТ-ПЦР и ПЦР с образцами выделенных нуклеиновых кислот ячменя выполняли коммерческим набором OneTube RT-PCRmix c использованием олигонуклеотидных праймеров серий Pazx и Actin, инициирующих амплификацию ген-специфичных продуктов длиной 282 bp и 369 bp соответственно. В ходе экспериментов выявлена общая тенденция к увеличению яркости свечения амплифицированных продуктов по мере повышения в контрольных образцах дробленых зернопродуктов доли ячменного солода. Разработанные способы основаны на ОТ-ПЦР- и ПЦР-анализе амплифицируемых локусов генов pazx и actin-7 Hordeum vulgare L. гель-электрофорезной детекцией с визуальной и программной интерпретацией получаемой электрофореграммы для последующего построения соответствующей процентной шкалы. При этом один из предложенных способов имеет сходство с ранее апробированным прототипом в части задействованных праймеров серии Pazx, но отличается протоколом постановки генетического теста. Дополнительно протестированный набор праймеров серии Actin, инициирующий амплификацию локуса гена «домашнего хозяйства» actin-7, проявил диагностический потенциал в определении относительной доли солода в дробленых зернопродуктах и может эффективно применяться при аналогичной оценке пивоваренного сырья даже из мутантных генотипов ячменя с дефицитом серпинов. Barley malt is the main ingredient for the production of fermented drinks, forming their taste, color and aroma, and in relation to beer, also the stability and quality of the foam. To control compliance with the standard of the technical regulation of the EEU 047/2018 on the permissible threshold of partial replacement of brewing malt with grain or products of its processing, it is necessary to create new methodological approaches, including those based on molecular genetic research methods. Therefore, the aim of this work was to develop methods for determining the relative proportion of barley malt in crushed grain products by RT-PCR and PCR. Extraction of nucleic acids from the sample prepared material was carried out using the commercial kit innuPREP Plant DNA Kit according to the protocol 2 recommended by the manufacturer. RT-PCR and PCR with samples of isolated barley nucleic acids were performed using the commercial kit OneTube RT-PCRmix using oligonucleotide primers of the Pazx and Actin series, initiating the amplification of gene-specific products with a length of 282 bp and 369 bp, respectively. In the course of the experiments, a general trend was revealed towards an increase in the brightness of the glow of the amplified products as the proportion of barley malt in the control samples of crushed grain products increased. The developed methods are based on RT-PCR and PCR analysis of amplifiable loci of the pazx and actin-7 genes of Hordeum vulgare L. by gel electrophoresis detection with visual and software interpretation of the resulting electrophoregram for subsequent construction of the corresponding percentage scale. At the same time, one of the proposed methods is similar to the previously tested prototype in terms of the involved primers of the Pazx series, but differs in the protocol for setting up a genetic test. An additionally tested set of primers of the Actin series, initiating amplification of the actin-7 housekeeping gene locus, showed diagnostic potential in determining the relative proportion of malt in crushed grain products, and can be effectively used in a similar assessment of brewing raw materials even from serpin-deficient barley mutant genotypes.