Determination of the relative proportion of malt in crushed grain products by competitive RT-PCR. Part 2

Abstract

Ячменный солод - основной полуфабрикат для приготовления пива, влияющий на его аромат, вкус, цвет, стойкость и качество пены. Для эффективного контроля за соблюдением норматива допустимого порога частичной замены пивоваренного солода зерном или продуктами его переработки необходимо создание соответствующих методологических подходов. Поэтому целью настоящего исследования являлась разработка способа определения относительной доли ячменного солода в дробленых зернопродуктах методом конкурентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). При постановке ОТ-ПЦР с образцами экстрагированных нуклеиновых кислот из пробоподготовленного материала использовано сочетание коммерческих наборов Encyclo Plus PCR kit и MMLV RT kit, а также олигонуклеотидных праймеров серии Paz7 и Pazx, генерирующих амплификацию фрагментов длиной 376 bp (Band 1) и 282 bp (band 2) соответственно. Таким образом, предложенный способ предусматривает пробоподготовку, экстракцию и амплификацию нуклеиновых кислот ячменя, а также гель-электрофорезную детекцию амплифицированных ОТ-ПЦР-продуктов с последующим программным анализом сохраненной электрофореграммы в приложении Adobe Photoshop и построением соответствующей процентной шкалы. В ходе эксперимента выявлена визуальная прослеживаемость динамики увеличения яркости свечения амплифицированных фрагментов длиной 282 bp (Band 2) по мере повышения в контрольных образцах дробленых зернопродуктов доли ячменного солода, тогда как интенсивность свечения фрагментов длиной 376 bp (Band 1), наоборот, имела склонность к относительному падению яркости сигнала амплификации. Эта закономерность подтверждена программным анализом данных максимального значения серого в Adobe Photoshop и математическими расчетами показателей Band 1/Band 2 и ∑ Band 1/∑ Band 2. Протестированный в настоящей работе способ проведения конкурентной ОТ-ПЦР имеет ряд схожих и отличительных признаков с ранее апробированным прототипом, приводящих к получению принципиально отличимых результатов, требующих иной интерпретации. Подобранный интерпретационный подход раскрывает диагностический функционал разработки и повышает ее практическую значимость. Barley malt is the main semi-finished product for making beer, affecting its aroma, taste, color, persistence and foam quality. For effective control over compliance with the standard of the permissible threshold for the partial replacement of brewing malt with grain or products of its processing, it is necessary to create appropriate methodological approaches. Therefore, the aim of this study was to develop a method for determining the relative proportion of barley malt in crushed grain products by competitive reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). When performing RT-PCR with samples of extracted nucleic acids from sample prepared material, a combination of commercial «Encyclo Plus PCR kit» and «MMLV RT kit», as well as oligonucleotide primers of the Paz7 and Pazx series, generating amplification of 376 bp fragments (Band 1) and 282 bp (band 2), respectively. Thus, the proposed method involves sample preparation, extraction and amplification of barley nucleic acids, as well as gel electrophoresis detection of amplified RT-PCR products, followed by software analysis of the stored electrophoregram in Adobe Photoshop and the construction of an appropriate percentage scale. During the experiment, visual traceability of the dynamics of the increase in the luminescence brightness of the amplified fragments 282 bp long (Band 2) was revealed as the proportion of barley malt in the control samples of crushed grain products increased, while the luminescence intensity of the 376 bp fragments (Band 1), on the contrary, tended to relative decrease in the brightness of the amplification signal. This pattern was confirmed by software analysis of the maximum gray value data in Adobe Photoshop and mathematical calculations of the Band 1/Band 2 and ∑ Band 1/∑ Band 2 values. The competitive RT-PCR method tested in this work has a number of similar and distinctive features with the previously tested prototype, leading to fundamentally different results that require a different interpretation. The selected interpretive approach reveals the diagnostic functionality of the development and increases its practical significance.