Ο βοτρύτης (παθογόνο αίτιο Botrytis cinerea) είναι μία από τις σημαντικότερες ασθένειες των κηπευτικών που καλλιεργούνται σε συνθήκες θερμοκηπίου στην χώρα μας κατά την περίοδο του χειμώνα-αρχές της άνοιξης. Σε καλλιέργεια μαρουλιού το παθογόνο προσβάλει το λαιμό των φυτών με αποτέλεσμα τη σήψη της βάσεως του στελέχους και την αποκοπή της κεφαλής από το ριζικό σύστημα. Για τρία συνεχή χρόνια (2010, 2011, 2012) έγινε μελέτη της επιδημιολογίας του παθογόνου σε μαρούλια υδροπονικής καλλιέργειας με καταγραφή των συνθηκών μικροκλίματος και του εναέριου πληθυσμού. Το παθογόνο εισερχόταν στο λαιμό των φυτών από τα κατώτερα εξασθενημένα φύλλα και προκαλούσε μόλυνση με ορατά συμπτώματα προσβολής 20 ημέρες μετά τη μεταφύτευση. Οι προσβολές ήταν αυξημένες όταν επικρατούσε παρατεταμένη υψηλή υγρασία (σχετική υγρασία, διύγρανση φύλλων) και αυξημένη συγκέντρωση εναερίου μολύσματος ενώ, η θερμοκρασία δεν είχε καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη της ασθένειας. Παράλληλα, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα διαφόρων προγραμμάτων χημικών επεμβάσεων κατά της ασθένειας. Έγιναν δύο ψεκασμοί ασφαλείας στο σπορείο σε συνδυασμό με μία ή δύο επιπλέον επεμβάσεις μετά τη μεταφύτευση, ανά 15μερα διαστήματα. Η συγκομιδή έγινε τουλάχιστον 4 εβδομάδες μετά την τελευταία επέμβαση μυκητοκτόνου. Οι ψεκασμοί ασφαλείας στο σπορείο με Daconil SC (chlorothalonil 50%) 3 ml·L-1, Teldor WG (fenhexamid 50%) 1.5 g·L-1, Signum WG (boscalid 26.7% + pyraclostrobin 6.7%) 1.5 g·L-1, Switch WG (fludioxonil 25% + cyprodinil 37.5%) 0.5 g·L-1 και Ortiva Οpti SC (azoxystrobin 8% + chlorothalonil 40%) 2.5 ml·L-1, μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα και την ένταση της προσβολής σε σχέση με το μάρτυρα. Τα μυκητοκτόνα Switch WG και Signum WG έδωσαν την καλύτερη καταπολέμηση ενώ τα Teldor WG και Daconil SC ήταν λιγότερο αποτελεσματικά. Η εφαρμογή ενός ή δύο επιπλέον ψεκασμών μετά τη μεταφύτευση μείωσαν περαιτέρω το επίπεδο της ασθένειας. Η σταθερή ύπαρξη στο θερμοκήπιο ανθεκτικού πληθυσμού του παθογόνου φαίνεται ότι δεν περιόρισε την αποτελεσματικότητα των βοτρυδιοκτόνων. Δύο κυρίαρχοι φαινότυποι ανθεκτικοί σε πέντε (QoIRBosRAniRBenHRDicMR) και επτά (HydRQoIRBosRAniRPhenRBenHRDicMR) διαφορετικού τρόπου δράσης ομάδες μυκητοκτόνων εντοπίστηκαν είτε στο εναέριο μόλυσμα, είτε απομονώθηκαν από φυτά του πειραματικού ή του ευρύτερου χώρου του θερμοκηπίου. Για τη μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ανθεκτικότητας η εναλλαγή μυκητοκτόνων στο πρόγραμμα επεμβάσεων βρέθηκε απαραίτητη. Με εξαίρεση τις επεμβάσεις μετά τη μεταφύτευση με Daconil SC (chlorothalonil 50%), σε όλες τις άλλες περιπτώσεις είτε δεν ανιχνεύθηκαν υπολείμματα μυκητοκτόνων κατά τη συγκομιδή ή ανευρέθηκαν σε συγκεντρώσεις κατώτερες από αυτές που έχουν θεσπιστεί από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα.Σε θρεπτικά υποστρώματα εμπλουτισμένα με διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεως βοτρυδιοκτόνων από εννιά διαφορετικές ομάδες, προσδιορίστηκε η ελάχιστη παρεμποδιστική συγκέντρωση (MIC) της βλάστησης των σπορίων και του σχηματισμού αποικίας σε 100 απομονώσεις του B. cinerea. Με τη μέθοδο της σημειακής εναπόθεσης σπορίων οι συγκεντρώσεις αυτές επιλέχθηκαν για το διαχωρισμό των επιπέδων ευαισθησίας σε 818 απομονώσεις του παθογόνου από μαρούλια και άλλα κηπευτικά. Τρεις φαινότυποι με πολλαπλή ανθεκτικότητα στις υδροξυανιλίδες (Hyd), τις στρομπιλουρίνες (QoI), τα καρβοξαμιδικά (Bos), τις ανιλινοπυριμιδίνες (Ani), τις φαινυλοπυρρόλες (Phen), τα δικαρβοξιμιδικά (Dic) και τα βενζιμιδαζολικά (Βen), [HydRQoIRBosRAniRPhenMRBenHRDicMR, QoIRBosRAniRBenHRDicMR, QoIRBosRBenHRDicMR] ανευρέθηκαν σε συχνότητα 7%, 12% και 6%, αντίστοιχα. Οι φαινότυποι αυτοί εντοπίστηκαν κυρίως σε καλλιέργεια θερμοκηπίου μαρουλιού στην περιοχή της Θεσσαλίας. Απομονώσεις ανθεκτικές μόνο στα βενζιμιδαζολικά (BenHR) βρέθηκαν στο 11% του δείγματος και προέρχονταν κυρίως από υπαίθριες καλλιέργειες μαρουλιού στη Μακεδονία και Πελοπόννησο. Σε χαμηλότερη συχνότητα (<5%) διαπιστώθηκαν φαινότυποι που παρουσίαζαν από 1 έως 5 διαφορετικούς συνδυασμούς ανθεκτικότητας στις χημικές ομάδες. Στο σύνολο των απομονώσεων που εξετάστηκαν δεν ανευρέθηκαν ανθεκτικά στελέχη στα μυκητοκτόνα fluazinam (δινιτροανιλίνες) και chlorothalonil (φθαλονιτρίλια). Από τα ευρήματα διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα η παρουσία φαινοτύπων του B. cinerea με πολλαπλή ανθεκτικότητα σε επτά διαφορετικές ομάδες μυκητοκτόνων και η παρουσία στελεχών με υψηλή ανθεκτικότητα στο fenhexamid (Hyd) και μέτρια στο fludioxonil (Phen), αντίστοιχα. Για τη μείωση των ζημιών από βοτρύτη η εφαρμογή στρατηγικής διαχείρισης της ανθεκτικότητας κρίνεται απαραίτητη.Διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα in situ επτά μυκητοκτόνων διαφορετικού βιοχημικού τρόπου δράσεως [pyraclostrobin (στρομπιλουρίνες), boscalid (καρβοξαμιδικά), fenhexamid (υδροξυανιλίδες), cyprodinil (ανιλινοπυριμιδίνες), fludioxonil (φαινυλοπυρρόλες), fluazinam (δινιτροανιλίνες) και chlorothalonil (φθαλονιτρίλια)], κατά εννιά επιλεγμένων με πολλαπλή ανθεκτικότητα απομονώσεων του B. cinerea. Νεαρά φύλλα μαρουλιού (ποικ. Penelope RZ) εμβαπτίστηκαν σε υδατικό αιώρημα μυκητοκτόνων, στη συνιστώμενη για ψεκασμό συγκέντρωση σε δ.ο. Μετά το στέγνωμα τα φύλλα τοποθετήθηκαν σε τριβλία Petri με αποστειρωμένο υπόστρωμα άγαρ. Ακολούθησε μόλυνση στη πάνω επιφάνεια με εναπόθεση ανεστραμμένου μυκηλιακού δίσκου διαμέτρου 5 mm ή σταγόνας αιωρήματος σπορίων συγκέντρωσης 5x104 mL-1. Η αποτελεσματικότητα αξιολογήθηκε με μέτρηση της διαμέτρου ανάπτυξης της κηλίδας προσβολής του παθογόνου, έπειτα από 3 (μόλυσμα μυκήλιο) ή 6 (μόλυσμα σπόρια) μέρες επώαση, αντίστοιχα, σε θάλαμο θερμοκρασίας 18°C και 10h φωτισμού. Τα pyraclostrobin (0.4 g·L-1) και fenhexamid (1.5 g·L-1) απέτυχαν να εμποδίσουν την ανάπτυξη κηλίδας προσβολής των ανθεκτικών σε αυτά φαινοτύπων σε όλες τις περιπτώσεις δοκιμών. Παρόμοια αποτελέσματα διαπιστώθηκαν για τα boscalid (0.8 g·L-1), cyprodinil (0.375 και 0.75 g·L-1) και fludioxonil (0.25 και 0.5 g·L-1) όταν χρησιμοποιήθηκε ως μόλυσμα μυκήλιο. Απεναντίας, τα μυκητοκτόνα fluazinam (0.4 g·L-1) και chlorothalonil (2.5 g·L-1) ήταν αποτελεσματικά σχεδόν εναντίον όλων (εκτός από μία περίπτωση) των φαινοτύπων του παθογόνου. Από τα αποτελέσματα διαφαίνεται η αδυναμία πρόσφατα εισαχθέντων μυκητοκτόνων να εμποδίσουν την προσβολή από ανθεκτικούς φαινοτύπους του B. cinerea που απομονώθηκαν από καλλιέργειες μαρουλιού.Με τη νέα μέθοδο της θερμικής αποδιάταξης υψηλής ανάλυσης (HRM) τριάντα έξι διαφορετικής ευαισθησίας απομονώσεις του B. cinerea διαχωρίστηκαν γονοτυπικά με βάση μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς που προσδίδουν ανθεκτικότητα στα μυκητοκτόνα fenhexamid, boscalid, pyraclostrobin, carbendazim και iprodione. Η βασική αρχή λειτουργίας της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός του ρυθμού αποδιάταξης του δίκλωνου DNA με τη βοήθεια φθορίζουσας χρωστικής και ο σχηματισμός των χαρακτηριστικών καμπυλών τήξης του κάθε γενοτύπου. Μετά από ταυτοποίηση των καμπυλών τήξης βρέθηκε ότι τα ανθεκτικά στο fenhexamid στελέχη παρουσίασαν μετάλλαξη της φαινυλαλανίνης είτε σε βαλίνη (58% των απομονώσεων) είτε σε σερίνη (42% των απομονώσεων) στη θέση 412 του γονιδίου erg27. Παρομοίως, τα ανθεκτικά στο boscalid στελέχη έφεραν τη μετάλλαξη της ιστιδίνης είτε σε αργινίνη (78%) είτε σε τυροσίνη (22%) στη θέση 272 του γονιδίου sdhB. Στα ανθεκτικά στο pyraclostrobin στελέχη η μετάλλαξη της γλυκίνης σε αλανίνη παρουσιαζόταν στη θέση 143 του κυτοχρώματος b αλλά όχι πάντοτε. Στην ίδια γενωματική περιοχή ανιχνεύθηκε η ύπαρξη ενός εσονίου 1205 βάσεων στο 43% των ευαίσθητων στα QoIs στελεχών. Η υψηλή και μέτρια ανθεκτικότητα στο carbendazim συνδυάστηκε με μεταλλάξεις σε δύο διαφορετικές, πολύ κοντινές θέσεις του γονιδίου BenA (E198A και 200Υ). Έντονος πολυμορφισμός διαπιστώθηκε στα μετρίως ανθεκτικά στο iprodione στελέχη καθώς στο γονίδιο bos1 ανιχνεύθηκαν τέσσερεις διαφορετικοί γενότυποι ήτοι: α) I365N (46%), β) I365S (17%), γ) Q369P & N373S (17%), δ) V368F & Q369H (20%). Επιπρόσθετη πληθυσμιακή κατάταξη των απομονώσεων με βάση την ύπαρξη μεταθετών στοιχείων boty και flipper έδειξε ότι το 80% των απομονώσεων έφερε και τα δύο μεταθετά στοιχεία, το 15% κανένα από τα δύο ενώ το 5% μόνο το boty μεταθετό στοιχείο. Η γoνοτύπηση έδειξε ότι στους περισσότερους φαινοτύπους πολλαπλής ανθεκτικότητας οι μεταλλάξεις ήταν τυχαίες, ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις υπήρξε υψηλή συσχέτιση ορισμένων μεταλλάξεων με συγκεκριμένους φαινοτύπους. Τα συγκριτικά πλεονεκτήματα της μεθόδου HRM έναντι των παραδοσιακών μοριακών τεχνικών την καθιστούν ιδανική για μελέτες ανίχνευσης ανθεκτικών στελεχών.
