Detecção De Mutações Definidoras De Linhagem Nas Variantes Alfa E Gama De Sars- Cov-2 Utilizando a Técnica De Amplificação Isotérmica Rt-Lamp

Abstract

Introdução As Variantes de preocupação (VOC - Variants of Concern) são variantes do vírus SARS-CoV-2 que possuem uma maior capacidade de infecção, algum nível de escape de anticorpos, diminuição na eficácia de tratamentos e/ou possível impacto nos métodos de diagnóstico. Estas variantes podem ser responsáveis por novos surtos e sua prevalência deve ser monitorada na população. O método padrão ouro para monitoramento de variantes é o sequenciamento genético, que apesar de ser extremamente robusto, necessita de reagentes caros e de pessoal extremamente capacitado. A técnica de Amplificação Isotérmica Mediada por Loop com transcriptase reversa (RT-LAMP) é uma técnica barata, de fácil aplicação e com potencial de distinguir amostras que contenham pequenas regiões com mutações e/ou SNPs. Objetivos O objetivo do estudo é diferenciar e identificar amostras que contenham dois conjuntos de mutações definidoras de linhagem: a deleção de nove nucleotídeos localizada na posição 11288 e as mutações L18F, T20N e P26S no gene que codifica a proteína Spike. Com a identificação das amostras que possuem esses dois conjuntos de mutações, é possível inferir a que variante pertencem. Métodos Desenhamos dois conjuntos de primers capazes de detectar duas regiões com mutações no genoma do SARS-CoV-2. Para a reação de RT-LAMP utilizamos o kit colorimétrico WarmStart desenvolvido pela empresa New England Biolabs (NEB) e obtivemos o resultado em 70 minutos. Para visualização das reações, utilizamos o aplicativo PhotoMetrix Pro em um celular Xiaomi (Redmi Note 8). A diferenciação de amostras negativas e positivas se dá pela mudança de cor no tubo da reação, de rosa (negativa) para amarela (positiva). Todas as amostras analisadas haviam sido previamente sequenciadas. Resultados A técnica é capaz de amplificar amostras que possuem as mutações alvo com um limite de detecção de ct 23. Em amostras com até essa quantidade de cópias, a sensibilidade do teste é de 81,82%, a especificidade de 100,00% e a acurácia de 88,89%. O teste apresenta potencial para ser usado para triagem de amostras em locais onde o sequenciamento não está disponível. Conclusão A técnica de RT-LAMP pode ser utilizada para detecção de mutações em amostras de SARS-CoV-2, e a presença destas mutações podem indicar que as amostras pertencem à uma variante específica. Com estes dados, é possível inferir a prevalência da variante ao longo do tempo na população, mesmo sem o aparato de sequenciamento.