Desarrollo de vectores para la construcción de recombinantes del virus de la poliedrosis nuclear de <i>Anticarsia gemmatalis</i> (oruga de las leguminosas)

Abstract

La “oruga de las leguminosas” Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga con amplia difusión geográfica, que afecta principalmente al cultivo de soja. En Brasil se desarrolló un bioinsecticida en base al baculovirus AgMNPV para el control de esta plaga, y su aplicación exitosa en más de un millón de hectáreas de soja, representó un ahorro significativo del presupuesto utilizado anteriormente en insecticidas químicos (Moscardi, 2002). En Argentina, esta plaga ha sido controlada durante las últimas décadas mediante el uso de insecticidas piretroides. En la actualidad, se han debido incrementar las dosis y el número de aplicaciones (de una a dos o tres por campaña), lo cual estaría indicando la aparición de variedades resistentes a estos pesticidas (Gamundi, com. pers.). En tales circunstancias, existe una creciente demanda de productos alternativos para su control. El inconveniente más significativo que limita la utilización más amplia de AgMNPV es su baja velocidad de acción, aspecto negativo que se acentúa en regiones templadas como nuestro país (Moscardi, 1999). Otro aspecto que genera interés en relación al estudio de los baculovirus, es su utilidad como vectores muy eficientes para la expresión de genes heterólogos (Luckow y Summers, 1988, O’Reilly eí al., 1992; King y Posse, 1992). El gran tamaño del genoma viral requiere la utilización de la recombinación homologa para introducir cambios dirigidos (Kitts y Possee, 1993; Pfeifer et al., 1997). Recientemente, esta metodología se utilizó con el objetivo de incrementar la potencia insecticida de los baculovirus salvajes. Se ensayaron distintas alternativas, que incluyen la expresión de toxinas específicas para insectos, hormonas de insecto o enzimas o deleciones de genes virales que afectan la metamorfosis (Wood y Granados, 1991, O’Reilly etal., 1991; Chejanovsky etal., 1995, Bonning y Hammock, 1996). En 1994 Cory et al. publicaron el primer trabajo en el que se utilizaron baculovirus mejorados genéticamente en un ensayo de campo. En este contexto, se inició el presente proyecto de Tesis, con el objeto de desarrollar un sistema de producción de recombinantes del virus de la poliedrosis nuclear de Anticarsia gemmatalis (rAgMNPV) que permitiera tanto la generación de AgMNPVs con mayor eficacia bioinsecticida contra plagas de la soja, como su utilización para la expresión de genes foráneos en un ambiente eucariota. Para ello, se localizó, clonó y secuenció el gen de la poliedrina (polh) de AgMNPV y sus regiones flanqueantes; se construyeron vectores de transferencia para la recombinación homologa con el locus polh y se desarrolló el primer sistema de expresión basado en AgMNPV (Arana et al., 2001). Por otra parte, se demostró la eficacia del sistema para la expresión de genes foráneos, a niveles muy altos y biológicamente activos (Arana et al., 2001; Arana et al.,2002). Mediante la utilización de dicho sistema se aislaron y caracterizaron recombinantes de AgMNPV que expresan una proteína neurotóxica (Txp I), específica de insectos. Los resultados obtenidos a partir de insectos tratados con estos recombinantes demostraron la eficacia de la modificación genética realizada. Se comprobó una disminución del 55-60% en el tiempo de muerte de larvas infectadas por el virus recombinante, en comparación con el producido por el virus silvestre. Los objetivos alcanzados sientan las bases para posteriores estudios de impacto ecológico del recombinante obtenido, con el fin de cumplimentar los requisitos imprescindibles para el registro del rAgMNPV como insecticida biológico de utilidad en esta región. Finalmente, los vectores de transferencia generados en el marco del proyecto permiten la potencial utilización del sistema para la expresión de dos o más genes con funciones relacionadas (subunidades proteicas). Este tipo de construcciones podría resultar importante desde el punto de vista biotecnológico para la producción masiva de estructuras proteicas complejas (antígenos, complejos multienzimáticos, etc.).

Generación de recombinantes del virus de la poliedrosis nuclear de <i>Anticarsia gemmatalis</i> (AgMNPV)

“…Los moldes utilizados en las diferentes reacciones de PCR fueron pAgPH [ORF de poliedrina y secuencias flanqueantes upstream (UP) y downstream (DW) clonados en pcDNAii (Arana, 2003)], pBSE1 (ORF del enhancin 1 (E1) de LdMNPV clonado en pBSSK) y pDsRed-N1 (a partir de este plásmido se amplificaron el ORF de DsRed1 y las secuencias polyA de SV40; Clontech). Todos los cebadores se diseñaron de la manera descripta en la explicación de la estrategia SOE PCR y, además, tenían agregadas las secuencias de los sitios de restricción únicos de la construcción final (pIERUPOD) (ver lista y secuencia en "Sección IV: Materiales y Métodos").…”

“…Para esto la secuencia de los Ppolh debía estar completa. En el caso de pIERUPOD-47, esto estaba confirmado a nivel de secuencia y, en el caso de pIERUPOD-21, existía la posibilidad de que las 62 pb iniciales faltantes del Ppolh de E1 no afectaran su función debido a que otro promotor muy tardío (el de p10, Pp10) retenía su función con sólo 60 pb (Arana, 2003), y a este Ppolh le quedaban 85 pb.…”

“…La segunda, de Zanotto et al (1992), presenta, entre otros, un análisis de restricción más detallado de la banda G de HindIII (de 7262 pb) y la secuencia de la región del gen de poliedrina, incluyendo sus secuencias flanqueantes (2085 pb en total). (Arana, 2003). Entre este último sitio SphI y el sitio 3´ de HindIII-G hay 2182 pb (ver figura 6.3).…”

“…El único interrogante correspondía al promotor de poliedrina de 85 pb que dirigía la expresión de E1. Sin embargo, consideramos altamente probable que esto no perjudicara su función como secuencia promotora, dado que el promotor de p10 (Pp10) retenía su función con sólo 60 pb (Arana, 2003). En el caso del clon pIERUPOD-47, ambos promotores tenían la totalidad de las 147 pb.…”