Desarrollo de un modelo experimental con larvas de <i>Ceratophrys</i> spp. (Anura: Ceratophryidae) para su aplicación en estudios ecotoxicológicos de plaguicidas: efectos sobre variables convencionales y bioacústicas

Abstract

La emisión de sonidos por larvas de Ceratophrys ornata constituyó un novedoso hallazgo en el cual se presenta la primera evidencia para larvas de anfibios anuros. Tal hallazgo condujo al desarrollo de una nueva línea de investigación, siendo el fundamento de este trabajo de tesis doctoral, habiéndose dividido la investigación en dos partes consecutivas y concatenadas. La primera parte consistió en generar las bases para poder desarrollar un modelo experimental con larvas de esta especie. Para ello, se propuso un protocolo de cría ex-situ de individuos de C. ornata, el cual permitió obtener individuos sanos a lo largo de todo el ciclo vital (desde huevo hasta adulto). Esto último fue posible gracias a la utilización del método de inducción artificial de la reproducción denominado AMPHIPLEX. Dicho método, permitió obtener huevos en distintas épocas del año, no todas coincidentes con el periodo reproductivo de la especie (verano), y recolectar datos su biología, dos logros que de otro modo hubiera resultado dificultoso dado el hábito de vida de la especie. En tal sentido, el presente trabajo de tesis aporta datos de la biología de C. ornata relativos a su reproducción (actividad reproductiva, cantidad de huevos depositados por puesta, porcentaje de eclosión de los huevos), crecimiento (curvas de crecimiento desde la etapa larval hasta la adultez), desarrollo (tiempo promedio en alcanzar determinados estadios), enfermedades (diagnóstico y tratamiento), comportamiento (llamada agonística, llamada de anuncio y reciprocidad y movimiento pedal) y biología general. Al mismo tiempo, la aplicación del protocolo en especies filogenéticamente relacionadas con C. ornata y de hábitos similares (C. cranwelli, C. aurita y Lepidobatrachus llanensis), permitió su validación. La cría ex-situ es una estrategia que evita la continua extracción de animales de su hábitat natural y sienta las bases para el desarrollo de investigaciones en aquellos casos que los estudios in-situ resultan imposibles o complejos de realizar. Una vez desarrollado el protocolo de cría en cautiverio de individuos de C. ornata, y mediante la obtención de larvas de distintos estadios del desarrollo, se describió la variabilidad de los sonidos producidos tanto en un medio acuático como aéreo. Previamente, se realizó una consulta interdisciplinaria con especialistas en sonidos, a partir de la cual se descubrieron algunos aspectos a mejorar en el sistema de grabación. Se realizó un procedimiento de calibrado y compensado del sistema de grabación que permitió obtener grabaciones de alta confiabilidad. Además, se implementó un método de mejoramiento de la relación señal-ruido, el cual permitió obtener grabaciones con espectros más nítidos y fáciles de analizar. Se realizaron además mediciones del sonido emitido por individuos de C. ornata en el medio aéreo mediante un sistema de medición adecuado (sonómetro), el cual permitió caracterizar el sonido tanto cuali como cuantitativamente mediante variables acústicas. Se concluye que para caracterizar adecuadamente un sonido de las características aquí presentadas (bajo nivel de presión sonora), resulta necesario utilizar instrumentos de medición calibrados con sistemas de referencia acústica. La variables analizadas fueron a) bioacústicas: duración del sonido (Ds), expresada en segundos (s), número de pulsos (Np), número de interpulsos (Nip), frecuencia dominante (Fd) expresada en Hertz (Hz); b) acústicas: nivel sonoro continuo equivalente (LAeq) expresado en decibeles (dB), nivel sonoro máximo (LAFmax, dB) y nivel sonoro que se ha igualado o superado durante el 90% del tiempo de medición (cercano al ruido de fondo; LAF90, dB). Se registró la emisión de sonidos desde el estadio 25 al 41, estadios luego de los cuales las larvas no emiten sonidos hasta completar el proceso metamórfico, momento en el cual los juveniles vuelven a producir sonidos manteniéndose esta situación durante todo el ciclo vital. Por último, la aplicación del protocolo de cría en otras especies de anuros filogenéticamente relacionados con C. ornata, permitió evaluar y describir la emisión de sonidos por otras larvas de anuros de la familia Ceratophryidae. Consecuentemente, se constató y registró el sonido emitido por larvas de C. cranwelli y C. aurita y la no emisión de sonidos por larvas de Lepidobatrachus llanensis dentro del rango de frecuencias evaluado. Por lo tanto, la hipótesis original que plantea que la emisión de sonidos está presente en todas las larvas de anuros macrófagas y carnívoras debe ser rechazada. Luego de describir los sonidos, se evaluó el contexto de emisión por parte de larvas de C. ornata, pudiéndose concluir que las mismas emiten sonidos en diferentes contextos (interacción intraespecífica o con un objeto), habiéndose incluido a los sonidos en la categoría de llamada agonística (distress call). Hasta el momento, no existían estudios que analicen la variación de estos sonidos desde fases tempranas del desarrollo larval y a lo largo de todo el ciclo vital. Respecto a la evaluación del mecanismo de emisión de sonidos, a partir de una serie de pruebas morfo-funcionales realizadas, se hipotetizó que el aire empleado en la producción de sonidos durante estadios larvales proviene del estómago, pasa por la glotis (donde existiría una estructura resonante) y luego por la cavidad bucofaríngea (sin salir de la misma). Además, se evaluaron interacciones predador-presa intra e interespecíficas, entre larvas de C. ornata y entre éstas y larvas que forman parte de su dieta habitual, en distintos estadios del desarrollo y bajo diferentes condiciones experimentales (densidad y proporciones predador-presa). Se concluye que C. ornata posee un mecanismo antipredatorio que disminuye la frecuencia de predación entre organismos conespecíficos ante la presencia de presas heteroespecíficas. Se evaluaron también interacciones intra e interespecíficas para larvas de C. cranwelli y L. llanensis con el objetivo de determinar similitudes y diferencias con el mecanismo antipredatorio de C. ornata. En tal sentido, se concluye que el mecanismo de Ceratophrys está compuesto por un rápido movimiento de la cola, más la emisión de sonidos y la consiguiente huida (escape) de la presa del predador. En cambio, si bien para L. llanensis también se describió un rápido movimiento de la cola seguido del escape de la presa del predador, no se registró la emisión de sonidos asociada. Más allá de las diferencias metodológicas, si se comparan los tres mecanismos se concluye que los mismos presentan el siguiente grado de eficiencia de mayor a menor: C. ornata, C. cranwelli, L. llanensis. A partir de los estudios anteriormente detallados se planteó una segunda parte con el objetivo de evaluar los efectos del clorpirifós (CPF), un plaguicida organofosforado de uso frecuente en la región Pampeana, sobre larvas de C. ornata y aplicar el modelo desarrollado en la primera parte. El primer objetivo fue evaluar efectos letales y subletales sobre las larvas expuestas a este plaguicida. Teniendo en cuenta que los plaguicidas organofosforados poseen acción neurotóxica por inhibición de la acetilcolinesterasa, los mismos pueden alterar al aparato de emisión de sonidos y al sonido en sí mismo. En tal sentido, se evaluaron no solo los parámetros ecotoxicológicos convencionales sino también el efecto sobre los parámetros normales del sonido. Los puntos finales ecotoxicológicos analizados fueron: mortalidad, alteraciones en la natación, presencia de anormalidades e inhibición del crecimiento. Además, se evaluaron las mismas variables bioacústicas antes detalladas (Ds, Np, Nip, Fd). La sensibilidad de la especie al CPF se encuentra cercana al percentil 26, teniendo en cuenta la curva de sensibilidades construida con datos de CL-50 a 96 h publicados para otras especies de anfibios anuros. En relación con los efectos subletales, la especie se encuentra cercana al percentil 5 (alteraciones en la natación) y 33 (presencia de anormalidades), teniendo en cuenta la curva de sensibilidades construida con datos de CE-50 a 96 h publicados para otras especies de anfibios anuros. El diseño experimental propuesto (larvas expuestas de forma individual), permitió demostrar que los efectos negativos del CPF, en el intervalo de concentraciones ensayadas, no revierten sino que se mantienen constantes. Se concluye que existe una progresión de efectos negativos del CPF, desde alteraciones en la natación seguidas por la presencia de anormalidades leves y luego severas hasta la muerte. Por último, se puso a prueba el modelo mediante la evaluación del sonido como punto final de efectos producidos por el CPF sobre larvas de esta especie. Se concluye que el sonido constituye un buen biomarcador de efectos subletales. A partir del resumen e integración de la información toxicológica existente sobre efectos del CPF en anfibios y exposición del CPF en el ambiente, mediante la herramienta de evaluación del riesgo ecológico, y la contextualización de los resultados obtenidos, se concluye que el CPF implica un riesgo muy bajo para las distintas especies de anuros evaluadas, al menos al considerar la exposición ante concentraciones esperadas en el ambiente (ecosistemas acuáticos pampeanos). El presente constituye el primer bioensayo de exposición de larvas de C. ornata a un agroquímico de uso frecuente en la región Pampeana y la primera evidencia de efectos sobre el sonido emitido por larvas de esta especie. Consecuentemente, constituye el primer estudio sobre dicha temática (efectos del CPF sobre el sonido) realizado con larvas de vertebrados acuáticos. Por sus características biológicas y su manejo en laboratorio (facilidad para criarlas en condiciones controladas), la especie resulta de gran interés como modelo de estudio en Ecotoxicología. El estudio se encuentra en un marco general de investigación de impacto de plaguicidas en agroecosistemas de la región Pampeana, junto al desarrollo y aplicación de estrategias de monitoreo, para la evaluación de efectos biológicos de plaguicidas sobre anuros autóctonos. El modelo probado resultará una herramienta útil para el desarrollo futuro de más experimentos, generando así un modelo completo de evaluación de efectos.

Evaluation of the toxicity of the sediments from an agroecosystem to two native species, Hyalella curvispina (CRUSTACEA: AMPHIPODA) and Boana pulchella (AMPHIBIA: ANURA), as potential environmental indicators

“…This amphipod is part of the native fauna and has been used in laboratory bioassays to assess sensitivity to different toxic agents (Giusto et al, 2012, Peluso et al, 2013a, Anguiano et al, 2014, Mugni et al, 2015, in assessments of environmental samples (Di Marzio et al, 1999, Míguez et al, 2012, Peluso et al, 2013a, Peluso et al, 2013b, Giusto et al, 2014, Peluso et al, 2016, Mac Loughlin et al, 2017, and as a test organism in certain field evaluations (Graça et al, 2002, Jergentz et al, 2004, Venturino et al, 2007, Mugni et al, 2012, Mugni et al, 2016. Although other species of amphibians have been used in bioassays as potential model indicators (Natale et al, 2006, Salgado Costa, 2016; only one protocol in Argentina, under the acronym of ANFITOX, has been found to be applicable to embryos and larvae of amphibians (Herkovits and Pérez-Coll, 1999). One native species, however, that has been employed in several ecotoxicological studies demonstrating its usefulness as a model indicator with respect to sensitivity to different families of pollutants is Boana pulchella (Bp; Natale et al, 2006, Agostini et al, 2009, Agostini et al, 2010, Junges et al, 2010, Brodeur et al, 2011, Brodeur et al, 2012, Peltzer et al, 2013, Pérez-Iglesias et al, 2015, Schuch et al, 2015, Pérez-Iglesias et al, 2017, Natale et al, 2018.…”

Embryonic ontogeny of three species of Horned Frogs, with a review of early development in Ceratophryidae

“…Samples were euthanized every 4 hr and preserved in buffered 10% formalin. The larvae were fed twice daily with a standardized diet that combined chopped cow liver and fish, live tadpoles, and Tubifex (Salgado Costa, ). In addition, we collected and examined five young tadpoles of Lepidobatrachus asper Budgett to compare some developmental events with those of the complete series of the remaining species.…”