Dengue virus RNA purification from human plasma: a comparison of two techniques

Abstract

Dengue virus RNA purification from human plasma is useful for research and clinical purposes. Dengue is endemic in the Espirito Santo State, Brazil, and it is progressively becoming a hard-to-control public health problem. Dengue virus types 1, 2 and 3 are currently found in Brazilian territory, and recently Dengue virus type 4 has been reported to enter Brazilian borders. This virus spreads rapidly during epidemic outbreaks, and thousands of patients are infected annually, with an underestimated number of deaths in consequence of hemorrhagic Dengue. Because this disease affects mainly developing countries, it is imperative that a robust, rapid and low cost method for viral nucleic acid purification is found. In this manuscript we compare two RNA extraction methods from serum/plasma of patients with clinical diagnosis of dengue. The QIAamp(®) UltraSens Virus Kit (Qiagen Inc., Valencia, USA) and the less expensive Chomczynski-Sacchi method were used to analyze a total of 47 samples. After nucleic acid purification, reverse transcription and polymerase chain reaction amplification with dengue virus type 2 specific primers were performed. This subtype is the most prevalent in our geographical location. Thirty-four samples were positive when RNA was extracted by the Chomczynski-Sacchi technique, whereas only 27 of these were positive when the QIAamp(®) UltraSens Virus Kit was used. These results favor the utilization of the more affordable technique for the purification of viral RNA, which is especially important for developing countries.

Desafios da extração do RNA do vírus da dengue

“…O RNA pode estar presente nessas amostras em baixas titulações, e a qualidade após a extração é crucial para as reações subsequentes 7 . Embora alguns vírus possam ser detectados no plasma, sem qualquer purificação anterior 32 , esse não é o caso do DENV.…”

“…A extração orgânica apresenta algumas desvantagens, como a possível separação incompleta das proteínas do RNA e a contaminação da fase aquosa pela fase orgânica. Além disso, as técnicas baseadas nesse tipo de extração podem ser demoradas, são trabalhosas, usam reagentes perigosos, necessitam de muita vidraria e utensílios plásticos e, por fim, podem ser inadequadas para manipulação de muitas amostras 7,21 . Por outro lado, essa é uma das técnicas que apresenta maior sensibilidade e pureza do RNA.…”

“…O RNA adsorvido à sílica é lavado com etanol e acetona e posteriormente é deixado para secar. Por fim, o RNA é eluído em um tampão aquoso livre de sal, e a sílica é removida por centrifugação 7,21,29 . De acordo com os autores do protocolo, essa técnica é barata, não exige muitos equipamentos do laboratório e disponibiliza RNA livre de RNAses, portanto, não degradado 7 .…”

“…Os métodos sorológicos detectam anticorpos contra o DENV e podem ser realizados somente após a fase aguda da doença (após o sexto dia de sintomas aproximadamente). Além disso, não permitem a sorotipagem e a quantificação viral 7,8 . O isolamento viral permite a detecção e a sorotipagem do DENV já na fase aguda da doença, porém não permite a quantificação viral.…”

“…O isolamento também apresenta a desvantagem de ter seu sucesso afetado por muitos problemas de manipulação e armazenamento das amostras, além da grande demanda de tempo, trabalho e instalações especiais. As metodologias moleculares, cujo objetivo é a detecção do genoma viral, tornaram-se excelentes ferramentas para diagnóstico e pesquisa do DENV, por serem mais rápidas e sensíveis que as outras metodologias [7][8][9][10] . Com o uso de técnicas moleculares, podem ser feitos testes diagnósticos sensíveis e variados estudos específicos do genótipo viral, importantes em muitas áreas 11 .…”