Cryopreservation by Vitrification of Vitis vinifera cv. “Red Globe” Zygotic Embryos and Effect on the Expression of DNA Methyltransferase Genes

Abstract

Mexico is a large producer of table grape (Vitis vinifera L.) and therefore it is important to develop protocols to store the grape varieties germplasm. The objective of the present work was to design a protocol for the cryopreservation by vitrification of zygotic embryos of V. vinifera cv. "Red Globe" and evaluate possible epigenetics changes. The plant vitrification solution 2 (PVS2) was utilized before the utilization of liquid nitrogen (LN). The effect of this protocol on embryo viability was tested by the triphenyl-tetrazolium chloride solution, as well as by the in vitro development of grape embryos into plantlet. A cDNA expression library of grape zygotic embryos was created to isolate expressed sequence tags of several DNA methyltrasferases. Gene expression of domains rearranged methyltransferase type 1 (DMR1) and DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 (MET1-2) isozymes was analyzed by quantitative reverse transcriptase PCR. The optimal conditions for vitrification were 10 min in 50% PVS2, followed by 10 min in 100% PVS2. Under these conditions, about 30% of plantlet was obtained from embryos after cryopreservation. It was recorded a reduction in the MET1-2 gene expression, which plays a role in the maintenance of DNA methylation. It is possible to cryopreserve viable grape zygotic embryos, although the treatment seems to induce alterations in the normal DNA methylation pattern of the zygotic embryo genome.

Etapas del protocolo de crioconservación y su efecto sobre la viabilidad y regeneración de embriones cigóticos de vid (Vitis vinífera L.)

“…Cabe destacar que, aún no se ha descrito un protocolo de crioconservación óptimo para la conservación de embriones cigóticos de vid. En trabajos previos hemos reportado la crioconservación de embriones cigóticos (García-Coronado, et al, 2016;Quijada-Rivera et al, 2022). En este sentido, el porcentaje de regeneración obtenido en este estudio fue mejorado respecto a nuestros estudios previos.…”

“…La crioconservación se realizó de acuerdo a lo descrito por García-Coronado et al (2016). Los embriones fueron expuestos a PVS2 [30 % (p/v) glicerol, 15 % (p/v) etilenglicol y 15 % (p/v) de dimetilsulfóxido (DMSO)] al 50 % por 10 min a 25 °C y después fueron expuestos a PVS2 al 100 % por 10 min a 4 °C.…”

“…La crioconservación es una técnica que permite conservar el germoplasma de tejidos y células en nitrógeno líquido (NL) a una temperatura de -196 °C con el uso de osmo y crioprotectores (González-Arnao et al, 2014;Nausch y Buyel, 2021). Entre los crioprotectores se encuentra la solución 2 de vitrificación de plantas (PVS2), la cual está compuesta por: glicerol 30 % (p/v), etilen-glicol 15 % (p/v), dimetilsulfóxido (DMSO) 15 % (p/v) y sacarosa 0.4 M. La PVS2 ha sido descrita como una solución crioprotectora eficiente y es la solución de vitrificación más utilizada para la crioconservación de tejidos vegetales (Sakai et al, 1990;Normah et al, 2019).…”

“…Mas aún, la PVS2 y el glicerol provocaron obscurecimiento del tejido (Lazo-Javalera et al, 2015;. García-Coronado et al (2016) reportaron alteración en los niveles de expresión del ADN metiltransferasas por la vitrificación en embriones cigóticos de vid cv. Red Globe.…”

ANÁLISIS DE LA PÉRDIDA IÓNICA DE YEMAS DE VID (Vitis vinifera L.) CRIOCONSERVADAS

“…Zhai et al (2003) crioconservaron brotes apicales de los cultivares "Cabernet franc", "Chardonnay", "Fengh 51" y "LN33", y reportan en promedio 36 % de regeneración. También actualmente se ha crioconservado mediante vitrificación brotes apicales, yemas axilares y embriones cigóticos utilizando la solución PVS2 (Ganino et al, 2012;Lazo-Javalera et al, 2015;García-Coronado et al, 2016).…”