Cryo-EM visualization of transfer messenger RNA with two SmpBs in a stalled ribosome

Abstract

In eubacterial translation, lack of a stop codon on the mRNA results in a defective, potentially toxic polypeptide stalled on the ribosome. Bacteria possess a specialized mRNA, called transfer messenger RNA (tmRNA), to rescue such a stalled system. tmRNA contains a transfer RNA (tRNA)-like domain (TLD), which enters the ribosome as a tRNA and places an ORF into the mRNA channel. This ORF codes for a signal marking the polypeptide for degradation and ends in a stop codon, leading to release of the faulty polypeptide and recycling of the ribosome. The binding of tmRNA to the stalled ribosome is mediated by small protein B (SmpB). By means of cryo-EM, we obtained a density map for the preaccommodated state of the tmRNA⅐SmpB⅐EF-Tu⅐70S ribosome complex with much improved definition for the tmRNA-SmpB complex, showing two SmpB molecules bound per ribosome, one toward the A site on the 30S subunit side and the other bound to the 50S subunit near the GTPase-associated center. tmRNA is strongly attached to the 30S subunit head by multiple contact sites, involving most of its pseudoknots and helices. The map clarifies that the TLD is located near helix 34 and protein S19 of the 30S subunit, rather than in the A site as tRNA for normal translation, so that the TLD is oriented toward the ORF. elongation factor Tu ͉ preaccommodated state ͉ rescue mechanism ͉ transtranslation ͉ transfer RNA-like domain

Lost in translation

“…L'ARNtm aminoacylé avec une alanine à son extrémité 3'-terminale, en complexe avec le facteur d'élongation Tu, pénètre dans le site A du ribosome. Lors de cette étape initiale de reconnaissance, deux molé-cules de SmpB sont associées à chaque ribosome bloqué, l'une sur la grande sous unité au contact du centre GTPase nécessaire au départ d'EF-Tu, et l'autre sur la petite sous unité, dans le site de décodage [14,15]. Le mode d'arrivée de la seconde protéine SmpB (liée à la grande sous-unité) est encore débattu : soit directement sur le ribosome, soit en complexe avec l'ARNtm.…”

“…Des contacts spécifiques entre l'ARN et la protéine sont situés à l'extrémité 3' de la boucle D et dans la boucle joignant les tiges H2a et T. Un angle d'environ 120° se forme entre H2a et le bras accepteur. Par cryomicroscopie électronique, nous avons pu visualiser le mode de fixation de SmpB seul ainsi que celui du complexe ARNtm/SmpB/EF-Tu·GTP sur un ribosome bloqué [13,15,19]. Les données obtenues confirment tout d'abord la liaison de la protéine SmpB à …”

“…La deuxième molécule est située dans le centre de décodage de la petite sous-unité comme le suggère l'étude cristallographique ( Figure 5A) ; ce site correspond au positionnement de la protéine avant l'arrivée de l'ARNtm (SmpB2). Ainsi, deux protéines SmpB stabilisent la conformation de l'ARNtm interagissant avec le ribosome bloqué en se liant aux deux sous unités [15]. Si l'étape de démarrage est désor-mais bien caractérisée d'un point de vue structural, les étapes ultérieu-res ( Figure 4, étapes 4 et 5) restent encore largement méconnues.…”

Structural aspects of trans‐translation

“…One can see that there is no space for pK1 within the decoding area of the ribosome and that pK1 is instead located at the intersubunit space on the L7/L12 side. Already in the preinitiation complex, the SmpB protein was shown to change its binding site on tmRNA (27) compared with that occupied in solution (45,46). We proposed that in the initiation complex, further movement of SmpB to a novel position should take place.…”

“…The only available structural information about tmRNA interactions with the ribosome is from cryoelectron microscopy (cryo-EM) reconstitution of the pre-accommodated state of the tmRNAÁSmpBÁEF-TuÁ70S ribosome complex obtained at $13-15 Å resolution (26,27). Two SmpB molecules were found in the complex, one binding to the 50S ribosomal subunit at the GTPase-associated center and the other to the 30S subunit near the decoding center.…”