CROMATOGRAFIA NEGATIVA EM AMINOHEXIL- AGAROSE: SEPARAÇÃO DE FRAGMENTOS Fab HUMANO

Abstract

RESUMO -Os fragmentos de imunoglobulina G são moléculas empregadas em testes diagnósticos e terapias. Usualmente são purificados por cromatografia de afinidade em proteínas A ou G imobilizadas em matrizes sólidas. No entanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, sendo a principal delas o alto custo. Como ligantes alternativos de baixo custo, têm sido propostos o emprego de diaminas imobilizadas. Neste trabalho foi avaliada a separação de fragmento Fab humano por cromatografia negativa (proteína alvo obtida na fração não-retida) em aminohexil-agarose, em diferentes sistemas tamponantes, na faixa de pH 6,0 a 8,5. A seletividade do adsorvente foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE e Western blot. Os resultados mostraram que a adsorção de proteínas na coluna ocorre entre os valores de pH de 7,0 a 8,5, tendo obtido fragmentos Fab separados dos fragmentos Fc na fração não-retida em tampão Tris-HCl pH 8,5. INTRODUÇÃOOs fragmentos Fab de imunoglobulinas G (IgG) vêm sendo empregados em diagnósticos e aplicações terapêuticas. Por apresentarem tamanho reduzido, o uso dos fragmentos em algumas aplicações é preferível em relação à IgG intacta, pois possibilitam maior poder de penetração e maior velocidade de circulação. Além disso, o uso desses fragmentos previne possíveis reações adversas relativas à função efetora da porção Fc da imunoglobulina (Yu e Ghosh, 2009;Roque et al., 2005; Rothlinberger et al., 2005; Ljunglof et al., 2007;Elbakri et al., 2010; Hollister e Hudson, 2005). Os fragmentos Fab são obtidos a partir da clivagem enzimática da IgG pela papaína ou por tecnologia do DNA recombinante (Hollister e Hudson, 2005;Cheung et al., 2003).A purificação dos fragmentos Fab é realizada principalmente por técnicas de cromatografia de afinidade em proteína A ou proteína G imobilizadas. Entretanto, esses ligantes possuem alto custo e podem sofrer degradação ou ocorrer seu desprendimento da matriz cromatográfica, resultando em contaminação do produto. Como alternativa a esses ligantes têm sido propostos ligantes de menor custo e que apresentem alta estabilidade, Área temática: Processos Biotecnológicos 1