Coupling to Polymeric Scaffolds Stabilizes Biofunctional Peptides for Intracellular Applications

Abstract

Here, we demonstrate that coupling to N-hydroxypropyl methacrylamide (HPMA) copolymer greatly enhances the activity of apoptosis-inducing peptides inside cells. Peptides corresponding to the BH3 domain of Bid were coupled to a thioesteractivated HPMA (28.5 kDa) via native chemical ligation in a simple one-pot synthesis. Peptides and polymer conjugates were introduced into cells either by electroporation or by conjugation to the cell-penetrating peptide nona-arginine. The molecular basis of the increased activity is elucidated in detail. Loading efficiency and intracellular residence time were assessed by confocal microscopy. Fluorescence correlation spectroscopy was used as a separation-free analytical technique to determine proteolytic degradation in crude cell lysates. HPMA conjugation strongly increased the half-life of the peptides in crude cell lysates and inside cells, revealing proteolytic protection as the basis for higher activity.

A Peptide‐Functionalized Polymer as a Minimal Scaffold Protein To Enhance Cluster Formation in Early T Cell Signal Transduction

“…We have previously shown that electroporation affords efficient import and homogenous cytoplasmic distribution of conjugates and free peptides. [21] Prior to testing the effect of the HPMA-SLP228 conjugate on protein microcluster formation, we determined the average intracellular concentrations of the conjugates achieved by electroporation, by using constructs with fluorescent labels (Figure S1 B). Cells were analyzed with a combination of intracellular fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and avalanche photodiode (APD) imaging.…”

Stabilisierung von Peptiden für intrazelluläre Anwendungen mit Phosphoramidat‐verzweigten Polyethylenglycol‐Ketten

“…Zuschriften zuvor beobachtet, [14] verlässt Fluorescein die Zellen in weniger als einer Stunde. Im Gegensatz dazu zeigen sowohl PEGylierte als auch unPEGylierte BH3-Peptide eine homogene Verteilung während der ersten 5 h und auch nach 6.5 h war die Fluoreszenz überwiegend homogen verteilt (Abbildung 3).…”

“…In einer früheren Studie haben wir ein HPMAgekoppeltes BH3-Peptid untersucht und beobachtet, dass ein Anstieg der proteolytischen Stabilität nicht von einer verlängerten intrazellulären Residenzzeit begleitet wurde. [14] Da wir diese Korrelation jedoch für mehrere andere Peptide nachweisen konnten, zeigt unsere Beobachtung im vorliegenden Experiment, dass das unPEGylierte BH3-Peptid ein proteolytisches Fragment bildet, das nicht direkt die Plasmamembran überwinden kann. [25] Daraufhin untersuchten wir den Einfluss der stabilisierenden PEG-Phosphoramidatmodifikation auf die intrazelluläre Aktivität der BH3-Peptide.…”

“…Danach haben wir die nur selten betrachtete intrazelluläre Verteilung und schließlich die biologische Aktivität der PEGylierten Peptide in intrazellulärer Umgebung untersucht. Hierbei gingen wir davon aus, dass die über den Verzweigungspunkt eingebrachten kleinen bis mittleren PEG-Ketten die Peptide signifikant stabilisieren, während [14] Caspase-3 ist eine Effektorcaspase, die während der frühen Phase der Apoptose aktiviert wird. [15] BID, das proapoptotische BH3-only Aktivatorprotein aus der Bcl-2-Familie, kann direkt mit BAX, einem proapoptotischen Multidomänen-Bcl-2-Effektorprotein interagieren, um BAX-Homooligomere in der äußeren Mitochondrienmembran zu formen, was zur Freisetzung von Cytochrom C führt und so schließlich Caspasen aktiviert.…”

“…[15] BID, das proapoptotische BH3-only Aktivatorprotein aus der Bcl-2-Familie, kann direkt mit BAX, einem proapoptotischen Multidomänen-Bcl-2-Effektorprotein interagieren, um BAX-Homooligomere in der äußeren Mitochondrienmembran zu formen, was zur Freisetzung von Cytochrom C führt und so schließlich Caspasen aktiviert. [16] Wir haben schon zuvor BID-BH3-Peptide benutzt, um den Einfluss der Präsentation auf linearen HPMAGerüsten [14] oder Multivalenz [17] in Bezug auf intrazelluläre Aktivität zu untersuchen. Beide Studien zeigten, dass das unmodifizierte Peptid keine intrazelluläre Aktivität aufweist.…”