Conjugated polymer nanoparticles for effective siRNA delivery to tobacco BY-2 protoplasts

Abstract

BackgroundPost transcriptional gene silencing (PTGS) is a mechanism harnessed by plant biologists to knock down gene expression. siRNAs contribute to PTGS that are synthesized from mRNAs or viral RNAs and function to guide cellular endoribonucleases to target mRNAs for degradation. Plant biologists have employed electroporation to deliver artificial siRNAs to plant protoplasts to study gene expression mechanisms at the single cell level. One drawback of electroporation is the extensive loss of viable protoplasts that occurs as a result of the transfection technology.ResultsWe employed fluorescent conjugated polymer nanoparticles (CPNs) to deliver siRNAs and knockdown a target gene in plant protoplasts. CPNs are non toxic to protoplasts, having little impact on viability over a 72 h period. Microscopy and flow cytometry reveal that CPNs can penetrate protoplasts within 2 h of delivery. Cellular uptake of CPNs/siRNA complexes were easily monitored using epifluorescence microscopy. We also demonstrate that CPNs can deliver siRNAs targeting specific genes in the cellulose biosynthesis pathway (NtCesA-1a and NtCesA-1b).ConclusionsWhile prior work showed that NtCesA-1 is a factor involved in cell wall synthesis in whole plants, we demonstrate that the same gene plays an essential role in cell wall regeneration in isolated protoplasts. Cell wall biosynthesis is central to cell elongation, plant growth and development. The experiments presented here shows that NtCesA is also a factor in cell viability. We show that CPNs are valuable vehicles for delivering siRNAs to plant protoplasts to study vital cellular pathways at the single cell level.

Como estudar interações entre nanopartículas e sistemas biológicos

“…31 Para sistemas que não possuem estas propriedades quí-micas, há possibilidade do uso de moléculas lisossomotrópicas, que inibem a acidificação lisossomal, aumentando o tempo de permanên-cia das partículas em seu interior e com isso as chances de ocorrer a liberação do conteúdo para o citoplasma. 32 …”

“…46 Martins et al demonstraram que nanopartículas lipídicas sólidas apresentavam taxa de internalização preferencial em linhagens de glioma humano (A172 e U87) em relação à macrófagos, fato que aumenta a relevância dessas nanopartículas como carreadores de fármacos anti-neoplási-cos. 47 Silva et al empregaram nanopartículas poliméricas para carrear siRNA em protoplastos de tabaco BY-2 e demonstraram que esse processo depende do tempo e da concentração. 32 Esses são apenas alguns exemplos da aplicação da citometria de fluxo para estudar a internalização de nanomateriais em células eucarióticas.…”

“…54 A inibição de endocitose pode ser abordada por métodos seletivos e não seletivos para cada tipo de endocitose, mediante emprego de inibidores químicos ou através de regulação da expressão gênica. 32 O uso de inibidores químicos é comum na caracterização da via de internalização, principalmente de nanomateriais, 55 como ocorre com carreadores de genes. 56 Os protocolos que utilizam estes inibidores são vantajosos, pois são de baixo custo e rápidos.…”

“…Essa internalização resultou em processamento mais lento quando comparado com nanopartículas de poliestireno havendo, ainda, acúmulo na região perinuclear, benéfica para entrega de DNA. 32 Estudos sobre colocalização são vastamente empregados na caracterização da via de internalização de nanomateriais. Em sua maioria, esses experimentos adotam duas estratégias: colocalizar as nanopartículas com i. proteínas envolvidas na endocitose (ex.…”

Phosphonium Polymethacrylates for Short Interfering RNA Delivery: Effect of Polymer and RNA Structural Parameters on Polyplex Assembly and Gene Knockdown

“…Various strategies for RNA delivery have been explored, such as the application of lipid-based delivery systems (lipoplexes and liposomes) [4][5][6] , nanoparticles [7][8][9] , viruses 10 , peptide-based systems 7 , polymers [11][12][13][14] and gold-based materials [15][16][17][18] .…”