Comparative proteomic analysis of mouse liver and brain isatin-binding proteins

Abstract

Isatin (indol-2,3-dione) is an endogenous indole, exhibiting various biological activities that are realized via its interacts with numerous target proteins (so-called isatin-binding proteins). To date, isatin-binding proteins have been characterized in the brain of mice and rats. In this study we have performed a comparative proteomic analysis of the isatin-binding proteins of the mouse liver and brain. Proteomic profiling of clarified lysates of membrane and soluble fractions of liver and brain homogenates was performed using 5-aminocaproyl-isatin as an affinity ligand. During affinity based separation of isatin-binding proteins of soluble and membrane fractions of mouse brain homogenates lysed with Triton X-100, 63 individual proteins were identified. A similar separation of mouse liver homogenate fractions during affinity chromatography resulted in identification of 80 proteins. All identified liver and brain proteins belonged to the following functional groups: (I) Carbohydrate metabolism and energy generation; (II) Lipid metabolism; (III) Metabolism of nucleotides and amino acids; (IV) Formation of the cytoskeleton, exocytosis; (V) Regulation of gene expression, cell division and differentiation; (VI) Antioxidant and protective proteins; (VII) Signal transmission and regulation of enzyme activity. The total number of isatin-binding proteins common for the brain and liver was only 12. The most common for the brain and liver of isatin-binding proteins was found in group VI (antioxidant and protective proteins), complete absence of coincidence in group II (lipid metabolism) and group IV (formation of the cytoskeleton, exocytosis). The observed differences in the profile of isatin-binding proteins appear to play an important role in the specific effects of isatin in certain organs.

The effect of deprenyl and isatin administration to mice on the proteomic profile of liver isatin-binding proteins

“…В таком контексте идентифицированные изатин-связывающие белки печени контрольных животных, которые при введении изатина или депренила перестают связываться с аффинным сорбентом (иммобилизованным аналогом изатина), по-видимому, являются специфическими мишенями, непосредственно взаимодействующими с изатином in vivo. [17]. Сначала гомогенат печени центрифугировали 5 мин при 500 g для удаления дебриса.…”

“…Аффинную хроматографию на 5-аминокапроилизатинсефарозе для последующего масс-спектрометрического анализа проводили в соответствии с ранее разработанным протоколом [17]. Осветлённые при помощи центрифугирования лизаты мембранной и растворимой фракций гомогената печени (концентрация белка примерно 10 мг/мл) добавляли к суспензии 5-аминокапроилсефарозы (1:1) и инкубировали 2 ч при 4°C и медленном перемешивании.…”

“…Элюат (30 мл) концентрировали до 0,25 мл при помощи центрифужного устройства Amicon Ultra ("Millipore", США). Белки экстрагировали смесью хлороформ-метанол [17], восстанавливали 20 мМ дитиотреитолом в 6 М хлориде гуанидина (рН 6,8) при 37°С в течение 60 мин; после карбкосиметилирования сульфгидрильных групп 0,17 мМ йодоацетамидом (37°С, 60 мин) и повторной хлороформно-метанольной экстракции осадок белков растворяли в 50 мМ бикарбонате аммония и подвергали трипсинолизу (сначала 1 мкг трипсина/100 мкг белка, 37°С, 60 мин; потом 2 мкг/100 мкг белка, 37°С, в течение ночи) [17]. Реакцию останавливали муравьиной кислотой (конечная концентрация 0,1%).…”

“…Для проверки возможных конкурентных взаимоотношений между изатином и депренилом за связывание с белками-мишенями in vivo мы исследовали влияние субхронического введения этих веществ мышам на профиль изатин-связывающих белков печени. Использование именно печени в качестве объекта исследования объясняется тем, что количество индивидуальных изатин-связывающих белков в этом органе существенно выше, чем в мозге [17]. К тому же именно в печени 354 Биомедицинская химия, 2018 том 64, вып.…”