Cloning and Characterization of Polyphosphate Kinase and Exopolyphosphatase Genes from Pseudomonas aeruginosa 8830

Abstract

Pseudomonas aeruginosa accumulates polyphosphates in response to nutrient limitations. To elucidate the function of polyphosphate in this microorganism, we have investigated polyphosphate metabolism by isolating from P. aeruginosa 8830 the genes encoding polyphosphate kinase (PPK) and exopolyphosphatase (PPX), which are involved in polyphosphate synthesis and degradation, respectively. The 690- and 506-amino-acid polypeptides encoded by the two genes have been expressed in Escherichia coli and purified, and their activities have been tested in vitro. Gene replacement was used to construct a PPK-negative strain of P. aeruginosa 8830. Low residual PPK activity in the ppk mutant suggests a possible alternative pathway of polyphosphate synthesis in this microorganism. Primer extension analysis indicated that ppk is transcribed from a ςE-dependent promoter, which could be responsive to environmental stresses. However, no coregulation betweenppk and ppx promoters has been demonstrated in response to osmotic shock or oxidative stress.

Induction of the pho regulon and polyphosphate synthesis against spermine stress in Pseudomonas aeruginosa

“…Pho regulon and polyphosphate against spermine stress 1043 test this hypothesis, we designed experiments to manipulate the intracellular polyP level and checked its consequence on spermine susceptibility. It has been reported that exopolyphosphatase (PPX) encoded by the ppx gene can hydrolyze polyP (Akiyama et al, 1993;Zago et al, 1999). The ppx gene of P. aeruginosa H103 was PCR amplified and cloned in pUCP18, termed pYCP5.…”

Polyphosphate Kinase of Acinetobacter sp. Strain ADP1: Purification and Characterization of the Enzyme and Its Role during Changes in Extracellular Phosphate Levels

“…In addition, the ppk mutant WH435 had a minor secondary PPK activity that was also expressed following a shift from phosphate starvation conditions to surplus conditions. It has recently been reported that Pseudomonas aeruginosa also contains an alternate pathway for polyP synthesis (22).…”

Análise do metabolismo de polifosfato e do operon pst em Pseudomonas aeruginosa.

“…Aparecem sublinhadas as sequências Shine-Dalgarno putativas próximas ao códon de iniciação de tradução de PPK de cada cepa (ATG ou GTG). Na sequência correspondente à cepa 8830 aparece indicada a região promotora de ppk: são mostrados o sítio de início da transcrição (TSS), determinado por primer extension (ZAGO et al, 1999), e os elementos putativos -35 e -10 reconhecidos pelo fator E . A sequência de aminoácidos de PPK predita é apresentada em baixo da sequência nucleotídica.…”

“…Contudo, em nenhuma dessas duas análises de expressão gênica foram detectadas alterações nos níveis de expressão de ppk (PA5242) ou de ppx (PA5241) em deficiência ou carência total de Pi. Em outra pesquisa, uma fusão transcricional do promotor de ppx de P. aeruginosa 8830 com lacZ, não mostrou qualquer tipo de modulação na transcrição desse gene (ZAGO et al, 1999). Por fim, mutantes phoU de E. coli e de P. aeruginosa são caracteristicamente Pho constitutivos e acumuladores de poliP (ALMEIDA et al, 2015;MOROHOSHI et al, 2002).…”

“…Ao contrário de E. coli, na qual os genes ppk e ppx formam um operon, em P. aeruginosa esses dois genes são adjacentes, porém, são transcritos em direções opostas (Figura 6)(ZAGO et al, 1999). A independência transcricional desses genes sugere que eles possam estar sendo regulados de forma antagônica, e poderia explicar por que P. aeruginosa, diferentemente de E. coli, acumula quantidades significativas de poliP, inclusive em condições normais de crescimento(KIM et al, 1998).A regulação da expressão de ppk e ppx ainda é pouco entendida em P. aeruginosa e em outras bactérias.…”