Clinical Utility of Droplet Digital PCR for Human Cytomegalovirus

Sedlak, Ruth Hall; Cook, Linda; Cheng, Anqi; Magaret, Amalia; Jerome, Keith R.

doi:10.1128/jcm.00803-14

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“…Some limitations in the clinical sensitivity of dPCR have been observed which may be linked to restricted sample volume inputs for dPCR platforms (44). However, this may be improved by concentration of master mixes (48) and/or sample extracts.…”

Section: Development Of Reference Measurement Systems For Pathogen Naatsmentioning

confidence: 99%

Standardization of Nucleic Acid Tests for Clinical Measurements of Bacteria and Viruses

Pavšič

Devonshire²,

Parkes³

et al. 2015

J Clin Microbiol

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f Nucleic acid-based tests for infectious diseases currently used in the clinical laboratory and in point-of-care devices are diverse. Measurement challenges associated with standardization of quantitative viral load testing are discussed in relation to human cytomegalovirus, BK virus, and Epstein-Barr virus, while the importance of defining the performance of qualitative methods is illustrated with Mycobacterium tuberculosis and influenza virus. The development of certified reference materials whose values are traceable to higher-order standards and reference measurement procedures, using, for instance, digital PCR, will further contribute to the understanding of analytical performance characteristics and promote clinical data comparability. Molecular approaches, such as nucleic acid (NA) amplification-based tests (NAATs) and sequence analysis, are increasingly replacing conventional microbiological methods, such as pathogen propagation in culture and techniques for the detection of antigens, for (i) viral load quantification, (ii) the detection of pathogenic viruses and bacteria, (iii) monitoring viral and bacterial resistance to therapeutic agents, and (iv) monitoring transmission across communities, as they often enable faster, more accurate, or more sensitive measurements (1, 2). However, commercial and in-house NAATs for infectious diseases utilize different technologies, reaction chemistries, and calibration materials, leading to demonstrable variability in the test results in terms of (i) numerical values (e.g., numbers of genome copies) for quantitative methods or (ii) presence or absence of the pathogen for qualitative methods (3-5).The In Vitro Diagnostics Directive (IVDD) in Europe has promoted assay standardization in the clinical laboratory community, through requiring manufacturers to provide information about the traceability of their calibrators (for definitions of terms in italics, see Table 1), in compliance with ISO 17511 (6). The concept of metrological traceability in clinical chemistry and laboratory medicine has been comprehensively discussed in several articles (7-9). For small-molecule measurements in clinical chemistry, such as those of blood glucose, creatinine, cortisol, and electrolytes, reference measurement procedures of high metrological quality are available which relate the quantity value of the calibrators and reference materials used in a calibration hierarchy traceable to the International System of Units (SI) as described in ISO 17511 (6, 8). However, for the majority of the more complex biomeasurements, including those based on NA testing and infectious pathogen detection, reference materials whose values are traceable to the SI and reference measurement procedures (with well-understood uncertainty) are not yet available. ISO 17511 indicates recognition of the fact that, for measurements of, for example, viral NAs (for human cytomegalovirus [CMV], human immunodeficiency virus [HIV], and hepatitis B virus [HBV]), typically WHO international standards (IS) are available, w...

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Section: Development Of Reference Measurement Systems For Pathogen Naatsmentioning

confidence: 99%

Standardization of Nucleic Acid Tests for Clinical Measurements of Bacteria and Viruses

Pavšič

Devonshire²,

Parkes³

et al. 2015

J Clin Microbiol

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“…1 By 5 days PI, total DNA was harvested to quantify the number of viral DNA copies found in these cells using digital PCR with 2 sets of HCMV-specific primers for UL55 and UL123exon4. 37 To accurately determine the number of cells input, genomic DNA copy was quantified using CCR5 gene (because 2 copies exist in 1 cell). 35 Combining the HCMV gene and CCR5 data, in a time course experiment, ;15 copies of HCMV DNA could be detected per infected PB-CD34 cell at days 1, 3, 5, 7, and 14 PI ( Figure 1B; supplemental Figure 2).…”

Section: Establishment Of Hcmv Latent Infection In Pb-derived Cd34mentioning

confidence: 99%

Latent human cytomegalovirus enhances HIV-1 infection in CD34+ progenitor cells

et al. 2017

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“…La PCR digitale, capable de quantifier les acides nucléiques circulants sans courbe de calibration, permet de s'affranchir de ces inconvénients [34]. Dans ce cadre, une étude a récemment prouvé l'utilité clinique de détecter l'ADN de cytomégalo-virus humain (hCMV) dans le sang de patients par la technique de dPCR en microgouttelettes [35]. Un suivi régulier de la charge virale est notamment requis pour évaluer la nécessité de prescrire des antiviraux aux patients ayant subi une greffe de cellules hématopoïétiques et qui présentent une hausse de la concentration sanguine en hCMV.…”

Section: Applications Biomédicales De La Pcr Digitaleunclassified

“…Un suivi régulier de la charge virale est notamment requis pour évaluer la nécessité de prescrire des antiviraux aux patients ayant subi une greffe de cellules hématopoïétiques et qui présentent une hausse de la concentration sanguine en hCMV. En outre, la PCR digitale en microgouttelettes s'est avérée plus précise que la qPCR, la charge virale quantitative pouvant être mesurée sur une échelle de quatre décades de concentrations [35]. Une autre application de la PCR digitale est la réalisation de tests de diagnostic prénatal non invasifs.…”

Section: Applications Biomédicales De La Pcr Digitaleunclassified

PCR digitale en micro-compartiments

et al. 2015

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> La détection efficace d'altérations génétiques dans les domaines de la cancérologie, de la virologie ou du diagnostic prénatal requiert des niveaux de sensibilité et de spécificité hors de portée des technologies conventionnelles. En réalisant l'amplification de molécules d'ADN uniques dans des compartiments indépendants, la PCR digitale (dPCR) en systèmes microfluidiques permet de dépasser ces limitations et de suivre ces marqueurs dans les fluides biologiques. Après une présentation non exhaustive des technologies disponibles, cette revue pré-sentera leur impact potentiel pour des applications biomédicales, notamment dans la prise en charge des patients atteints de cancers. < De la PCR quantitative à la PCR digitaleDe nombreuses techniques ont été appliquées à la détection d'altéra-tions génétiques dans les tumeurs. Le choix de la technique employée repose sur un compromis entre divers critères : le coût, la sensibilité, la disponibilité et l'adéquation avec le type d'échantillon analysé (Figure 1). De nos jours, une des méthodes les plus couramment utilisées en recherche clinique pour la détection de mutations est la discrimination allélique par PCR quantitative (qPCR). Cette méthode permet l'amplification de molécules d'ADN présentes dans un échantillon et le suivi de cette amplification en temps réel [2, 3] avec une sensibilité entre 1-10 %. Cette sensibilité autorise l'analyse de tissus tumoraux, dans lesquels la proportion de clones mutants est très élevée, mais reste insuffisante pour la détection de variants rares ou celle d'ADN tumoral circulant extrait d'effluents biologiques, incluant le plasma. Ces applications nécessitent en effet de nombreuses optimisations de la méthode conventionnelle de qPCR afin d'augmenter sa sensibilité et de détecter efficacement les séquences cibles [4]. Ainsi, la détection et la caractérisation d'altérations génétiques sous représentées au sein d'échantillons biologiques complexes (sang, urine, selles, etc.) représentent un défi particulier pour la qPCR. En effet, ces séquences spécifiques de tumeurs sont très diluées au sein de séquences très proches (elles ne différent dans certains cas que

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Clinical Utility of Droplet Digital PCR for Human Cytomegalovirus

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Standardization of Nucleic Acid Tests for Clinical Measurements of Bacteria and Viruses

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Latent human cytomegalovirus enhances HIV-1 infection in CD34+ progenitor cells

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