Tratamentos utilizando óleos essenciais têm sido cada vez mais explorados na tentativa de contornar a resistência bacteriana e suprir essa necessidade emergente. Diante da escassez de estudos sobre os efeitos dos óleos essenciais no tratamento de infecções genitais em equinos e da busca por terapias alternativas e eficazes, este estudo teve como objetivo verificar a ação antimicrobiana do óleo essencial de melaleuca (Melaleuca alternifolia) in vitro contra microrganismos isolados do sêmen e sistema reprodutivo de garanhões. Amostras colhidas da fossa uretral e do sêmen de um garanhão em idade reprodutiva foram submetidas ao cultivo microbiológico. Em seguida, realizou-se a confecção das lâminas com as colônias desenvolvidas e coloração de Gram para identificação dos microrganismos. As colônias identificadas foram reinoculadas em placas de petri com meio de cultura BHI e ágar Sabouraud dextrose e incubadas à 36°C por 24 horas para obtenção de monoculturas. Foram realizados testes de catalase com água oxigenada e de hemólise com placas ágar sangue. As culturas isoladas foram classificadas em colônias fúngicas, Bacillus cereus, Staphylococcus spp. e Micrococcus spp. Foi realizado antibiograma com os antibióticos ceftiofur, ampicilina e enrofloxacina, antifúngicos ketoconazol e itraconazol, e com óleo o essencial de melaleuca nas concentrações 100, 50, 25, 12,5 e 6,25%. A susceptibilidade aos antimicrobianos e ao óleo essencial foi determinada pelo método qualitativo de concentração inibitória mínima. Os patógenos isolados mostraram sensibilidade ao ceftiofur e a ampicilina. Em contrapartida, demonstraram resistência à enrofloxacina e aos antifúngicos testados. O óleo essencial melaleuca demonstrou eficácia antibacteriana nas concentrações superiores a 50% e antifúngica, nas concentrações superiores a 25%.