Caracterización del Gen de la Proteína de Dos Aislamientos del Virus del Mosaico del Pepino (CMV), Obtenidos de Plátano y Banano (Musa spp)

Abstract

<p>El presente estudio se adelantó dentro de un proyecto de investigación para obtención de plantas resistentes al virus del mosaico del pepino (CMV), mediante la transformación y expresión del gen de la proteína de la cápside de CMV en plantas transgénicas de variedades comerciales de plátano y banano (Musa spp). Se trata de una estrategia reciente que ha sido utilizada con éxito en varios cultivos comerciales. El CMV fue detectado serológicamente (DAS-EUSA) en hojas de plátano cv. Dominico Hartón y de banano cv. Gros Michel que presentaban síntomas de mosaico. El virus se purificó parcialmente a partir de hojas infectadas de <em>Nicotiana tabacum</em> y con la ayuda del microscopio electrónico de transmisión, se identificaron partículas isométricas de aproximadamente 30 nm dc diámetro. El peso molecular de la proteína de la cápside en geles desnaturalizados de poliacrilamida (SDS-PAGE) fué de 28 kDa. El patrón electroforético del RNA viral de doble cadena (dcRNA) fué similar para los dos aislamientos de CMV obtenidos de plátano y banano. Utilizando la dcRNA como patrón, se sintetizó cADN por transcripción reversa y, a partir de éste, se amplificaron por PCR los genes de la proteína de Ia cápside (GPC) de ambos aislamientos. Los productos de la amplificación de aproximadamente 890 pares de bases (pb), que contenían el GPC, se donaron en el plásmido vector Bluescript KS (+/-). El análisis de restricción con endonucleasas y la secuenciación del GPC de ambos aislamientos, indicó que éstos pertenecen al subgrupo I (tipificado por el aislamiento DTL). El análisis de la secuencia nucleotídica y de aminoácidos de ambos genes, indicó una homología del 99% y un alto grado de conservación con otros miembros del subgrupo I de CMV. El GPC se está donando en plásmidos vectores para su transformación en variedades comerciales de plátano y banano en Colombia.</p><p> </p><p><strong>Characterization of the Coat Protein Gene of two Cucumber MosaicVirus (CMC) Isolates from Plantain and Banana (Musa spp)</strong></p><p>The final objective of this study is to genetically engineer cucumber mosaic virus (CMV) resistance in edible <em>Musa</em> spp.in Colombia, by means of expressing the CMV coat protein gene in transgenic plants. This strategy has been successfully employed in other crops. CMV was serologically detected in leaves of commercially grown bananas (cv. Gros Michel) and plantains (cv. Dominico-Harton) showing mosaic symptoms. CMV was partially purified from infected tissue of Nicotiana tabacum. Transmission electron microscopy examination showed the presence of viral isometric particles of approximately 30 nm in diameter. The molecular weight of the coat protein subunit was approximately 28 kDa as determined by SDS-PAGE. Analysis of double-stranded RNA (dsRNA) indicated that the isolations present in both varieties had similar dsRNA profiles, characteristic of CMV. cDNA was reverse transcribed using viral dsRNA as the template, and the coat protein genes (CPG) of the two CMV isolates were amplified by the polymerase chain reaction (PCR). The amplified products of approximately 890 bp, containing the CPG, were cloned into the plasmid vector Bluescript KS (+/-). Based on the pattern obtained from the digestion of the amplified CP genes with Msp 1 and DNA sequencing data, the two CMV isolates were classified into the serotype subgroup I (typified by isolate DTL). Computer analysis of DNA sequences of the CP genes derived from both CMV isolates showed a 99% homology between them at the nucleotide and amino acid level as well as a high level of conservation with other members of the CMV subgroup I. The CPG of CMV are now being cloned into plant transformation vectors for their genetic engineering into banana and plantain commercial cultivars.</p>

Estandarización de un método de detección molecular del Cucumber mosaic virus (cmv) en banano ecuatoriano

“…Para el diseño de nuevos primers de detección, se utilizaron los polimorfismos del gen que codifica la proteína de cápside del virus, obtenidos de la base de datos del GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information). Varios estudios reportan este gen para la detección de cmv (Rizos et al 1992;Reichel et al 1996;Mariño 1997;Gutiérrez et al 2004), el cual es de gran interés por guardar relación directa con los factores de virulencia para la mayoría de las plantas hospedantes del virus (Mochizuki y Ohki 2011;Mochizuki et al 2014). Las secuencias disponibles reportadas en GenBank para cmv aislado en banano americano tienen los siguientes números de accesión: AM055602.1, DQ640743.1, AM158321.1, DQ152254.1, U32858.1, U32859.1, M98501.1, M57602.1.…”

“…Los ARN subgenómicos (RNA 4 y RNA 4A) codifican para la CP (proteína de la cápside) y para la 2b (proteína supresora del silenciamiento génico) (Ding et al 1994;Jacquemond 2012). Toda esta información ha contribuido a establecer mecanismos de detección de este patógeno (Reichel et al 1996).…”

“…En el mencionado estudio, la sensibilidad del método ELISA se verificó con extractos vegetales con el virus sin diluir o en preparaciones con el extracto diluido hasta 100 veces. La sensibilidad de la RT-PCR [Reverse-Transcription PCR (reacción en la detección de estas variantes virales (Reichel et al 1996).…”

Clonación del gen de la cápside protéica de una cepa colombiana del Virus del Mosaico del Pepino (CMV) para su expresión en plantas por transformación mediante Agrobaderium

“…EI.CMV puede infectar más de 8oo especies de plantas y se encuentra distribuido en todo el mundo. El gen de la cápside proteica (CP) del CMV se ha usado para producir plantas transgénicas que han mostrado protección contra infecciones causadas por el CMV (Nakajima, 1993;Quemada, r99r); recientemente un gen CP, procedente de una cepa de CMV que infecta el plátano, ha sido caracferizado (Reichel, 1996) y su secuencia fue depositada en el Banco de Genes (GenBank) (Benson,r996). A continuación se describe la construcción de dos vectores binarios para la expresión del gen CP en plantas.…”