Ca2+-calmodulin-dependent modification of smooth-muscle myosin light-chain kinase leading to its co-operative activation by calmodulin

Abstract

It has recently been shown that at relatively high molar ratios of myosin light-chain kinase (MLCKase) to calmodulin (CM) almost complete inhibition of the kinase activity occurs [Sobieszek (1991) J. Mol. Biol. 220, 947-957]. This inhibition resulted in a highly co-operative activation of MLCKase by CM, whereas the opposite activation (of CM by kinase) was hyperbolic, as expected (unco-operative). This difference in activation was observed only for kinase preparations preincubated with sub-stoichiometric amounts of CM, and only when micromolar concentrations of Ca2+ were present. The inhibitory effect was variable and depended not only on the concentration ratio of kinase to CM but also on the MLCKase preparation. For most of the preparations full inhibition required 5-15 min of preincubation at 25 degrees C and a 3-6-fold molar excess of kinase over CM. The inhibition was reversible, since full activity could be obtained after saturation of the kinase by additional CM. The inhibitory effect did not require ATP (excluding phosphorylation-type modifications of the kinase), and dephosphorylation of the kinase was not involved, since inhibition of an endogenous MLCK phosphatase by microcystin-LR did not decrease the inhibitory effect. Since the co-operative activation by CM was observed for cross-linked MLCKase preparations enriched in kinase dimers, but was absent for the analogous preparations enriched in the oligomers, we concluded that Ca(2+)-CM-dependent changes in the oligomeric state of the kinase were responsible for the modification observed. The exact nature of these modifications remains to be established.

Purification and Characterization of a Smooth Muscle Myosin Light Chain Kinase-Phosphatase Complex

“…Although we favor this suggestion, it is clear that this would be difficult to distinguish experimentally from an indirect inhibition resulting from dephosphorylation catalysis by the phosphatase. A CaM-dependent inhibition of the kinase activity at low CaM:MLCKase molar ratios has already been demonstrated (34). However, we concluded previously that the inhibition does not result from dephosphorylation catalysis by the endogenous KAMPPase.…”

Supramolecular species of smooth muscle myosin light chain kinase. 1. Characterization and percent distribution in solution

“…Як було показано раніше, майже повне пригнічення активності кінази спостерігається пі сля її передінкубації при субстехіометричних мо лярних співвідношеннях з СаМ [14]. Таке при гнічення пояснювалося перерозподілом між різ ними формами кінази за час передінкубації до початку вимірів її активності [12]. Дані цієї роботи показують, що співвідношення між різними форма ми кінази до активації залишається практично незмінним після її активації.…”

“…Наші попередні дослідження in vitro показали, що в разі передінкубації кінази (перед додаванням субстра ту) з субстехіометричними концентраціями Са 2+ -СаМ її активність може зменшуватися в декілька разів. Припускалося, що така модифікація може бути пов'язана із зміною надмолекулярної ор-НАДМОЛЕКУЛЯРНІ ФОРМИ КІНАЗИ ЛЕГКИХ ЛАНЦЮГІВ МІОЗИНУ ганізації кінази [12]. Модифікації подібного типу можуть мати місце in vivo, виконуючи роль тонкої настройки активності ферменту.…”

“…Виділення білків. КЛЛМ та СаМ виділяли із м'язового шлунка індика, як описано в роботах [12][13][14]. їхні концентрації виз начали, користуючись коефіцієнтами поглинання А 2 78…”

“…Наявність димерів у розчинах КЛЛМ вперше було показано за допомогою методу ультрацентрифугування [17], а раніше в роботах Собешека і співавт. [14] при пускалося існування гексамерів і цим пояснювала ся позитивна кооперативність при активації КЛЛМ кальмодуліном [12].…”